Diplômée de l'Université de New York et de la prestigieuse Tisch School of the Arts, Molly Shannon démarre sa carrière de comédienne en animant à l'Up Front Comedy Theater de Los Angeles un spectacle improvisé intitulé The Rob and Molly Show.

Molly Shannon apparaît pour la première fois au cinéma en 1989 dans Le Fantôme de l'opéra de Dwight H. Little et intègre, dès 1995, l'équipe du culte Saturday Night Live. Elle y campe des personnages loufoques tels Mary Katherine Gallagher, une écolière catholique binoclarde, qu'elle développera dans le long-métrage Superstar (1999), et se lance dans des imitations de Liza Minnelli, Courtney Love ou encore Monica Lewinsky. Parallèlement, elle tourne en guest star dans des séries télévisées comme Seinfeld et Mystères à Twin Peaks.

Dès 1998, Molly Shannon s'intéresse davantage au cinéma et fait de la comédie son genre de prédilection. Après le torturé Happiness de Todd Solondz, on la voit ainsi aux génériques d'Une nuit au Roxbury, de Mafia blues, aux côtés de Robert De Niro et Billy Crystal, de College attitude ou encore du Grinch. Elle joue également à deux reprises sous la direction des frères Farrelly, dans Osmosis Jones (2001) et L'Amour extra large (2002).

Molly Shannon s'illustre ensuite dans la comédie romantique Un amour à New York, puis revient à un ton plus ouvertement comique Mon boss, sa fille et moi et Little Man. En 2005, elle intègre la cour de Marie-Antoinette, mais son goût pour la comédie potache la rattrape très vite avec un rôle dans Scary Movie 4 et un autre dans Evan tout-puissant. En 2008, elle s'essaie à l'animation en prêtant sa voix à l'un des personnages d'Igor.