Lola Dueñas naît à Madrid, d'un père acteur du petit écran et d'une mère manageuse. Elle fait ses premiers pas en tant que comédienne dans les années 1990 dans des courts métrages et à la télévision espagnole, dans le téléfilm A mi moda (TV) et dans des séries télévisées telles que Periodistas ou, un peu plus tard, Policías où elle tient un rôle récurrent. On la voit, dans les années 2000, dans ses premiers longs métrages, campant des personnages secondaires dans des genres très variés. En 2002, elle collabore pour la première fois avec Pedro Almodóvar, qui lui propose d'interpréter Matilde, personnage de second plan, dans Parle avec elle. Elle retrouvera Pedro Almodóvar à trois reprises : Volver (2005), film grâce auquel elle remporte un prix d'interprétation féminine collectif au Festival de Cannes avec ses partenaires, Etreintes brisées (2009), puis ...
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