Après avoir pris des cours de théâtre, Stéphane Audran fait sa première apparition au cinéma en 1957 dans Le Jeu de la nuit de Daniel Costelle, où elle joue aux côtés de Maurice Pialat. Elle tient ensuite un petit rôle non crédité devant la caméra de Jacques Becker pour Montparnasse 19. Son charme acidulé séduit tout de suite Claude Chabrol, qui la fait tourner dès 1959 dans Les Cousins, film du tout début de la nouvelle vague où il porte déjà un regard féroce sur la province et sa petite bourgeoisie. Cette rencontre décisive amène l'actrice à entamer une longue collaboration avec ce réalisateur qu'elle finira par épouser en 1964 après s'être séparée de Jean-Louis Trintignant.
Tour à tour vendeuse rêveuse dans Les Bonnes Femmes (1960), maîtresse du tueur Landru (1962), bourgeoise fortunée et lesbienne dans Les Biches (1968), épouse adultère dans La Femme infidèle (1968) et Les Noces rouges (1973), ou encore institutrice amoureuse du Boucher (1969), elle cultive son apparence de femme de tête à la beauté froide et aristocratique. Ces rôles de séductrice au cœur dur plaisent beaucoup à Luis Buñuel, qui la fait jouer dans Le Charme discret de la bourgeoisie. En 1979, elle remporte le César du meilleur second rôle pour sa composition dans Violette Noziere, où elle joue aux côtés d'Isabelle Huppert, qui fait ici sa première incursion chez Chabrol.
Stéphane Audran a toujours su choisir ses rôles avec clairvoyance, mais autant sa beauté était idéalement exploitée dans l'univers chabrolien, autant elle est sous-employée chez des cinéastes comme Samuel Fuller (dans Au-dela de la gloire et Les Voleurs de la nuit) ou Claude Sautet (dans Vincent, Francois, Paul et les autres). Dès la rupture avec Chabrol en 1980, elle change totalement son type de rôles au cinéma. Désormais, elle joue les personnages déplaisants et vulgaires (Coup de torchon, Mortelle randonnée), excellente dans le registre odieux. Le Festin de Babette, où elle campe avec tendresse le rôle-titre, celui d'une Française exilée au Danemark, ravive son souvenir au public. En 2012, le film bénéficie d'ailleurs d'une ressortie dans les salles obscures. En 1999, elle joue une nouvelle fois avec Catherine Deneuve dans Belle Maman de Gabriel Aghion, puis deux ans plus tard dans J'ai faim !!! de Florence Quentin. Cette orientation vers la comédie la cantonne quelque peu à des rôles secondaires.
En 2006, l’actrice tourne une dernière fois avec Isabelle Huppert et Claude Chabrol dans . Elle donne ainsi pour la cinquième fois la réplique à son fils, Thomas Chabrol, après Au petit Marguery ou Jours tranquilles à Clichy, notamment. Deux ans plus tard, elle accompagne Louise Bourgoin lors de ses premiers pas sur grand écran dans La Fille de Monaco, réalisé par Anne Fontaine.