Née en 1995 à Asheville en Caroline du Nord, Margaret Qualley est la fille de l’actrice Andie MacDowell et de l’ex-mannequin Paul Qualley. Sa première passion est la danse, qu’elle étudie à partir de 14 ans à la North Carolina School of the Arts. À 16 ans, elle décroche une place convoitée dans le programme d'été de l'American Ballet Theatre à New York. Alors qu’on lui propose d'intégrer une formation prestigieuse, elle décide d’arrêter la danse, lassée par une quête de perfection sans fin et par les pressions exercées sur le corps et le poids des danseuses.
Elle se lance dans le mannequinat et signe avec l’agence IMG. Elle défile ainsi pour de grands couturiers et bénéficie d’un confort matériel qui lui permet de se consacrer à sa nouvelle passion : l’art dramatique. Elle intègre la Royal Academy of Dramatic Art de Londres et obtient un peu par hasard son premier rôle au cinéma en 2013. Alors qu’elle rendait visite à son petit ami de l’époque, Nat Wolff, sur le plateau de Palo Alto, la réalisatrice Gia Coppola lui propose d’apparaître dans le long-métrage et de donner la réplique à James Franco.
L’année suivante, elle entame des études à l’université de New York mais abandonne les cours à l’issue d’un semestre pour se consacrer à la série HBO The Leftovers, dans laquelle elle campe durant trois saisons le personnage de Jill, la fille du shérif Kevin Garvey (Justin Theroux).
En parallèle de la série qui est saluée par la critique, elle se fait remarquer dans la comédie policière The Nice Guys aux côtés de Ryan Gosling et Russell Crowe, ainsi que dans une publicité déjantée pour le parfum Kenzo World réalisée par Spike Jonze, dans laquelle elle démontre ses talents de danseuse.
Après The Leftovers, elle enchaîne les seconds rôles dans des productions passées inaperçues (Donnybrook, Native Son) ou froidement accueillies (les films Netflix IO et Death Note). En 2019, elle croise la route de Brad Pitt dans Once Upon a Time… in Hollywood de Quentin Tarantino où elle arbore un look hippie dans la peau d’une membre de la secte de Charles Manson. La même année, elle est au générique de la mini-série Fosse/Verdon où son interprétation de la légende de Broadway Ann Reinking lui vaut une nomination au Emmy Award du meilleur second féminin.
Elle donne ensuite la réplique à Kristen Stewart (Seberg) et Sigourney Weaver (Mon année à New York) et s’offre même une incursion dans le jeu vidéo avec Death Stranding d’Hideo Kojima. En 2021, sa renommée s'étend grâce à la mini-série Netflix Maid dont elle tient le rôle principal, celui d’une jeune mère victime de violences conjugales qui tente de subvenir à ses besoins et celle de sa fille en devenant femme de ménage. Elle y a pour partenaire de jeu sa mère, Andy MacDowell, et est nommée à l’Emmy Award et au Golden Globe de la meilleure actrice dans une mini-série.
Devenue l’une des jeunes actrices les plus en vues du moment, Margaret Qualley tourne sous la direction de Claire Denis (le sensuel Stars At Noon, Grand Prix au Festival de Cannes 2022), d’Ethan Coen (le road-movie loufoque Drive-Away Dolls) et de Yorgos Lanthimos (le multi-récompensé Pauvres créatures et le dérangeant Kinds of Kindness).
En 2024, elle s’essaie au registre horrifique avec The Substance de la Française Coralie Fargeat. Remarqué au Festival de Cannes où il a emporté le Prix du Scénario, ce film de body horror met en scène une actrice en perte de vitesse (Demi Moore) qui se fait injecter une étrange substance pour donner vie à une autre version d’elle-même, plus jeune et plus belle.
Emilie Schneider