Melvil Poupaud débute au cinéma grâce à sa mère, attachée de presse, qui lui permet de rencontrer le réalisateur Raoul Ruiz. Il a dix ans quand ce dernier lui donne son premier rôle dans La Ville des pirates en 1983. Suivent deux autres collaborations, deux nouvelles oeuvres teintées de fantastique et d'aventure, avec L'Eveillé du pont de l'Alma et L' Ile au trésor. En 1989, sa carrière s'accélère lorsqu'il tourne sous la direction de Jacques Doillon dans La Fille de quinze ans et qu'il est nommé pour l'occasion au César du Meilleur espoir masculin.

Après un second rôle dans L'Amant de Jean-Jacques Annaud, Melvil Poupaud est révélé dans Les Gens normaux n'ont rien d'exceptionnel qu'il tourne sous la direction de Laurence Ferreira Barbosa et qui lui permet d'obtenir une deuxième nomination pour le César du meilleur espoir masculin. En 1995, il interprète un jeune homme ténébreux et mystérieux dans Le Plus Bel Age de Didier Haudepin et Le Journal du séducteur de Danièle Dubroux. La même année, on le retrouve en amoureux transi et hésitant dans Conte d'été d'Eric Rohmer. Mais sa carrière est toujours liée à Raoul Ruiz, cinéaste fétiche qu'il retrouve notamment pour la fable Trois vies et une seule mort (1995), le drame psychanalytique, Généalogies d'un crime (1996) et Le Temps retrouvé (1998).

Compagnon de route de jeunes cinéastes tels Graham Guit (Le Ciel est à nous, Les Kidnappeurs) ou Marion Vernoux (Reines d'un jour), Melvil Poupaud est en 2003 à l'affiche du Divorce de James Ivory et des Sentiments de Noémie Lvovsky. En 2005, cette valeur sûre du cinéma français est la vedette du Temps qui reste, drame de François Ozon où il joue le difficile rôle d'un jeune homme apprenant qu'il n'a plus que quelques mois à vivre. Après le drame, c'est le film policier avec une adaptation du roman d'Agatha Christie, L'Heure zéro, dont la distribution bien remplie comprend également François Morel, Danielle Darrieux, Laura Smet et Chiara Mastroianni.

En 2006, il passe à la réalisation avec Melvil, où il se met lui-même en scène. Par la suite, il traverse l'Atlantique pour jouer le french lover dans Broken english, puis replonge dans le drame, aussi bien intime (Un homme perdu) que familial (Un conte de Noël) avant d'interpréter le célèbre hors-la-loi Jesse James dans Lucky Luke de James Huth.

Après une apparition dans Speed Racer des frères Wachowski, il retrouve en 2010 François Ozon pour un petit rôle de jeune drogué victime d’une overdose dans Le Refuge puis rejoint le casting de L'Autre monde de Gilles Marchand où il joue le frère sadique de Louise Bourgoin. Fidèle, il a aussi un petit rôle dans la fresque romantique de son mentor Raoul Ruiz, Mystères de Lisbonne. L'année suivante, il donne de nouveau sa chance à une débutante, Géraldine Bajard, en jouant le rôle principal de son premier film La Lisière, celui d'un médecin muté dans une petite ville et mis à l'épreuve par un groupe d'adolescents du coin.

L’année 2012 est particulièrement chargée pour Melvil Poupaud qui prend part à trois projets très différents les uns des autres. Le comédien est tout d’abord à l’affiche du décalé et étrange L'Orpheline avec en plus un bras en moins, puis incarne le fils de Nathalie Baye, désirant devenir une femme, dans le troisième film du prodige québécois Xavier Dolan (Laurence Anyways). Enfin, il prend part aux Lignes de Wellington de Valeria Sarmiento, l'épouse de son père de cinéma Raoul Ruiz, décédé peu de temps avant d’avoir pu mettre le film en boite.

En 2015, Melvil Poupaud est à l'affiche de pas moins de quatre longs métrages : Fou d'amour, un film étrange où l'acteur campe un curé guillotiné, Tête baissée, un thriller dans lequel il interprète un repris de justice infiltrant la mafia bulgare du proxénétisme, Vue sur mer d'Angelina Jolie Pitt où il est le compagnon de Mélanie Laurent et enfin Le Grand Jeu, thriller réaliste inspiré de l'affaire Tarnac aux côtés d'André Dussolier. Choisissant ses films avec soin, il poursuit avec Victoria, Le Portrait interdit, La Belle et la Belle, Une jeunesse dorée et Grâce à Dieu de François Ozon, dans lequel il campe un mari et père de famille ayant été victime de pédophilie. Il retrouve le cinéaste pour un second rôle dans Eté 85.

L'acteur tombe ensuite sous le charme de Fanny Ardant dans Les Jeunes amants, puis tourne sous la direction de Arnaud Desplechin dans le drame Frère et soeur, où il a pour partenaire Marion Cotillard. Le film bénéficie d'une présentation au festival de Cannes 2022, tout comme Petite Fleur de l'Argentin Santiago Mitre, un étrange thriller où le personnage de Melvil Poupaud est assassiné par son voisin...