Avec son visage carré et sa carrure imposante, il était prédestiné à incarner les héros sans peurs ni reproches. Le Duke, de son surnom, débute sa carrière comme accessoiriste. John Ford le repère et le lance grâce à Hangman's House (1928). Les deux hommes deviennent amis et tourneront de nombreux films. Le cinéaste le recommande pour le tournage de La Piste des geants (1930) sous la direction de Raoul Walsh. Il décroche un rôle de cavalier assuré et adopte définitivement John Wayne comme nom de scène. La société Republic spécialisée dans la production de western fait de lui son acteur vedette. Il tourne dans de nombreuses séries B. Ces dernières sont plus que formatrices pour sa carrière. En 1939, il retrouve John Ford, son acolyte, dans La Chevauchée fantastique. Il crève l'écran dans ce fleuron du western.
Dès lors, il incarne l'archétype du cow-boy téméraire investit par la volonté de faire triompher la loi. Il traverse tous les mythes hollywoodiens de la conquête de l'Ouest. Avec La Riviere rouge (1948) mis en scène par Howard Hawks, il s'immisce parfaitement dans la vie du ranch. Ce n'est pas sans humour qu'il incarne le shérif Chance de Rio Bravo (1956). Ce dernier remporte un tel succès que l'acteur et le réalisateur s'en inspirent pour El Dorado (1967) et Rio Lobo (1970). Dans L'homme qui tua Liberty Valance(1962), il donne la réplique à James Stewart.
Il fait des incursions hors du film de western mais sans abandonner le registre de la virilité. C'est ainsi qu'il est marin dans Opération dans le Pacifique (1951), boxeur dans L'Homme tranquille (1952) ou patron de chapiteau dans Le Plus Grand Cirque du monde (1964). Il excelle particulièrement dans les films de guerre comme les Diables de Guadalcanal (1951) ou Le Jour le plus long (1962).
Dans les années 50, sa renommée le pousse à fonder Batjac, sa propre société de production. Parallèlement à la comédie, il s'essaye à la réalisation. Il filme en 1960 un véritable chef-d'oeuvre Alamo, un long-métrage d'une rare violence. L'année 1969 est à marquer d'une pierre blanche pour John Wayne puisqu'il remporte un Oscar pour sa prestation dans Cent dollars pour un shérif. En pleine guerre du Vietnam, il dirige Les Bérets Verts (1968), film patriotique où se dessine les opinions républicaines de Wayne. Ce film exaltant les valeurs guerrières provoque de nombreuses polémiques. Avec un titre prémonitoire, son dernier film Le Dernier des geants (1976) marque la fin de sa carrière. Il y interprète un tireur d'élite qui choisit sa propre mort. Il s'éteint en 1979 des suites d'un cancer. De sa pléthorique filmographie, on retient surtout ses collaborations avec John Ford, Raoul Walsh et Howard Hawks qui lui offrent ses meilleurs rôles.