Parallèlement à sa brillante scolarité dans un lycée catholique pour filles, Rachel Griffiths se passionne pour la danse. Diplômée en théâtre, elle rejoint la troupe The Woolly Jumpers avec laquelle elle se produit à Geelong.

Sa carrière de comédienne débute à la télévision : elle apparaît dans le téléfilm The Feds (1993), tient le rôle vedette de la série australienne Secrets (id.) et interprète un personnage régulier dans l'émission comique Jimeon en 1994. La même année, elle décroche, grâce à P.J. Hogan, son premier rôle au cinéma, celui de Rhonda, la meilleure amie de Muriel, alias Toni Collette, dans Muriel. Sa prestation lui vaut l'Australian Film Institute du meilleur second rôle. En 1997, elle tourne à nouveau sous la direction de P.J. Hogan pour les besoins de la comédie romantique Le Mariage de mon meilleur ami.

Entre temps, elle joue dans deux films à la tonalité plus dramatique : Jude (1996) de Michael Winterbottom avec Christopher Eccleston, et My son the fanatic (1997) d'Udayan Prasad. Son rôle de Bettina, la prostituée, lui vaut d'ailleurs d'être citée au British Independent Film Award.

Rachel Griffiths alterne également les tournages entre la Grande-Bretagne (Les Géants (1998), Divorcing Jack (id.), Coup de peigne en 2001) et l'Australie (Amy (1998) et La Chance de ma vie en 1999). En 1998, elle est nommée à l'Oscar du meilleur second rôle pour son interprétation de Hilary Du Pré dans Hilary and Jackie (id.) d'Anand Tucker, ainsi qu'au Golden Globe, au Screen Actor's Guild Award et au British Independent Film Award.

En 2001, Rachel Griffiths interprète la mère de Johnny Depp dans Blow de Ted Demme, et Annie-Mary, une jeune femme aspirant à la carrière de chanteuse, dans la comédie Annie-Mary à la folie ! de Sara Sugarman.

Cette même année marque un tournant important dans sa carrière puisqu'elle commence à apparaître sur petit écran dans une série HBO s'apprêtant à devenir culte : Six pieds sous terre. Rachel Griffiths y campe Brenda Chenowith, la petite amie de Nate Fisher (Peter Krause) ayant un problème avec sa sexualité et son frère (Jeremy Sisto). La comédienne tient ce rôle jusqu'à l'arrêt de la série en 2005.

En 2006 et jusqu'à 2011, elle trouve un autre rôle régulier dans Brothers & Sisters, celui de

Sarah Walker, aînée responsable et protectrice de la famille Walker. Parallèlement, elle est sur grand écran la directrice Gordon dans Sexy Dance porté par un Channing Tatum peu connu à ce moment et joue par la suite d'autres seconds rôles dans Burning Man, Underground: The Julian Assange Story, Dans l'ombre de Mary: La promesse de Walt Disney et Tu ne tueras point, la nouvelle réalisation de Mel Gibson.