Né en Louisiane, Zachary Levi déménage beaucoup dans son enfance, avant que sa famille ne décide de s’installer en Californie. Dès l’âge de six ans, il fait preuve d’un réel intérêt pour les activités artistiques et apparaît dans de nombreuses productions locales où il chante, danse et joue la comédie. Après le lycée, il décide de tenter sa chance à Los Angeles et brûle les planches dans des pièces de théâtre.

Il obtient son premier rôle pour le petit écran en 2002 dans le téléfilm Bigshot : Confession d’un Bookmaker. Il campe ensuite un employé de bureau agaçant durant quatre saisons de la sitcom Less Than Perfect avant de craquer pour Charisma Carpenter dans le téléfilm Une célibataire à New-York. Il fait également des apparitions dans les séries Division d'élite et Larry et son nombril. La chance n’est pas encore de son côté puisqu’il joue aux côtés de James Van Der Beek dans le pilote de la série Three, qui ne verra finalement pas le jour. Il se tourne alors vers le cinéma en incarnant le collègue de Martin Lawrence dans Big Mamma 2 avant de jouer dans le film potache Wieners: Saucisses Piquantes.

La consécration arrive en 2007 lorsqu’il est choisi pour jouer le rôle-titre de la série Chuck, qui suit les aventures d’un employé d’une boutique de matériel informatique propulsé dans le monde de l’espionnage. Irrésistible en héros maladroit, Zachary Levi séduit le public et la critique. Malgré des résultats d’audience en dents de scie, la série échappe plusieurs fois à l’annulation grâce à la mobilisation constante des fans.

Parallèlement à son rôle dans Chuck, Zachary Levi continue avec plus ou moins de succès sa carrière sur grand écran. Il est notamment le héros du film indépendant Shades of Ray en 2008, qui lui permet de donner la réplique à Kathy Baker et Sarah Shahi. Eclectique dans ses choix, il est également à l’affiche d’Alvin et les Chipmunks 2. En 2010, puis en 2011, il fait à nouveau le choix de l’animation, cette fois-ci chez Disney, en prêtant sa voix au prince Flynn Rider de Raiponce et du court-métrage Tangled Ever After.

Cette même année, le réalisateur Kenneth Brannagh le choisit pour être le Fandral de son Thor, compagnon d’arme du dieu nordique joué par Chris Hemsworth. Mais pour cause d’agenda surchargé, le comédien doit se rétracter au profit de Joshua Dallas. Ce n’est que deux ans plus tard, sous la direction d’Alan Taylor, qu’il endosse le rôle pour Thor : Le Mondes des Ténèbres puis en 2017 pour Thor: Ragnarok.

Trois ans après l'arrêt de Chuck, Zachary Levi décroche en 2015 l'un des rôles principaux de Heroes Reborn, reboot de la série Heroes. L'acteur incarne Luke Collins, un homme cherchant à tout prix à venger la mort de son enfant. Mais cette nouvelle mouture ne convainc pas et le programme est annulé à l'issue d'une seule saison.

La carrière de l'acteur se partage par la suite entre des doublages de jeux vidéo et de films d'animations, et des apparitions dans des comédies horrifiques (Blood Fest, Office Uprising). Il parvient toutefois à se faire remarquer grâce à deux séries acclamées par la critique, Captive sur Netflix, adaptée d'un roman de Margaret Atwood, et La fabuleuse Mme Maisel, qu'il rejoint le temps de quelques épisodes des saisons 2 et 3.

En 2019, Zachary Levi est choisi pour tenir le rôle-titre de Shazam!, une comédie d'action familiale DC Comics dans laquelle un adolescent a la capacité de se transformer en super-héros. Il reprend ce rôle irrévérencieux et immature en 2023 pour Shazam! La Rage des dieux, où il doit affronter les Filles de l'Atlas, interprétées par Helen Mirren, Lucy Liu et Rachel Zegler.