Guillaume Gallienne se tourne vers le métier de comédien à l'âge de 19 ans et entre ainsi au cours Florent en 1991. L'année suivante, il obtient un petit rôle dans le film de Charles Nemes, Tableau d'honneur, aux côté de François Berléand et d'Eric Elmosnino. Il se concentre ensuite sur le théâtre et développe ses talents de comédiens jusqu'à devenir pensionnaire de la Comédie Française en 1998. La même année, il tourne dans le film franco-argentin La Leçon de tango de Sally Potter avant de donner la réplique à l'humoriste Elie Kakou (qui décède dans l'année) dans Monsieur Naphtali d'Olivier Schatzky.

Guillaume Gallienne développe dès lors un intérêt certain pour la comédie, participant ainsi à des films tels que Jet Set (2000) de Fabien Onteniente aux côtés de Lambert Wilson et de Bruno Solo, ou Fanfan La Tulipe (2003) de Gérard Krawczyk, partageant ainsi la vedette avec Vincent Perez, Penélope Cruz et Didier Bourdon. En 2004, il incarne le psychanalyste de Guillaume Canet dans le premier film de Gilles Lellouche, Narco, comédie délirante dans laquelle il retrouve François Berléand.

Après avoir participé à la comédie chorale Fauteuils d'orchestre (2006), Guillaume Gallienne obtient un petit rôle dans le film de Sofia Coppola, Marie-Antoinette (2006). Il rencontrera d'ailleurs deux ans plus tard un autre membre de la famille Coppola, Nicolas Cage (neveu de Francis Ford Coppola), dans le second opus de Benjamin Gates et le Livre des Secrets (2008), dans lequel il a incarne un policier français un peu caricatural. Entre temps, il joue l'un des premiers rôles de la comédie La Jungle, dans laquelle il incarne l'un des deux fils-à-papa qui font le pari fou de survivre 7 jours et 7 nuits dans Paris avec 7 euros.

Guillaume Gallienne semble porter une attention toute particulière aux films politico-historiques, comme le prouvent ses participations à des films comme Mon colonel (2006), sur la guerre d'Algérie, Le Candidat (2006), à propos des élections présidentielles, et le téléfilm Adieu De Gaulle, Adieu (TV) (2009). Mais le comédien ne délaisse pas pour autant l'humour. En 2008, on peut le retrouver ainsi dans l'émission "Le Grand Journal de Canal +" dans laquelle il anime "Les Bonus de Guillaume" (sketches comiques à propos du cinéma). Il participe également au film choral Musée haut, musée bas (2008) de Jean-Michel Ribes, au film musical Le Concert de Radu Mihaileanu, avant de jouer dans la dernière comédie de Pascal Thomas, Ensemble, nous allons vivre une très, très grande histoire d'amour... (2009), aux côtés de Julien Doré et de Marina Hands. En 2010, il incarne Jacques dans la comédie L’Italien d’Olivier Baroux avec Kad Merad et Valérie Benguigui puis donne la réplique en 2012 à Gérard Depardieu et Edouard Baer dans Astérix et Obélix : au service de Sa Majesté.

2013 marque un tournant dans la carrière de Guillaume Gallienne : il passe à la réalisation avec Les Garçons et Guillaume, à table ! adapté de son one-man-show lui-même inspiré de sa propre vie et récompensé à la Quinzaine des Réalisateurs. Le film, dont il tient le premier rôle, est un succès public et critique puisqu'il remporte pas moins de cinq César, dont celui du meilleur film et du meilleur acteur. Cette reconnaissance lui permet de s’affranchir des seconds rôles auxquels il était cantonné jusque-là. Aussi l’année suivante interprète-t-il Pierre Bergé, le conjoint d’Yves Saint Laurent, dans le biopic de Jalil Lespert consacré au célèbre couturier.

Après U en 2005 et Sammy 2 en 2011, Guillaume Gallienne s’essaie à nouveau au doublage avec deux films familiaux :  Paddington (2014), dans lequel il donne vie à l'adorable ours au duffle-coat, et Le Petit prince (2015), tiré de la célèbre oeuvre de Saint-Exupéry. En 2016, le comédien est à l'affiche d'Éperdument, qui lui offre l'occasion de donner la réplique à Adèle Exarchopoulos dans une histoire d'amour impossible et passionnelle entre une détenue et un directeur de prison. La même année, il tient le haut de l’affiche de Cézanne et moi de Danièle Thompson qui marque les retrouvailles avec Guillaume Canet plus de dix ans après Narco. Ce dernier interprète Emile Zola tandis que Gallienne prête ses traits au peintre Paul Cézanne.

En 2017, Guillaume Gallienne repasse derrière la caméra pour mettre en scène Maryline, le portrait d'une femme modeste qui rêve de devenir comédienne.