Après avoir passé son enfance dans un pensionnat de sa Franche-Comté natale, le jeune Damien Jouillerot se lance dans des études de boulangerie. En 2001, alors qu'il est en première année, il voit débarquer un certain Gérard Jugnot dans son village, alors en repérages pour Monsieur Batignole. Sa demande d'autographe se transforme en véritable sketch, qui séduit l'acteur-réalisateur. Etonnant coup du destin : Damien Jouillerot obtient un petit rôle dans Monsieur Batignole et débute une inattendue carrière cinématographique à seulement 16 ans.

Le jeune comédien voit dès lors s'ouvrir de nombreuses portes. Il s'illustre sur petit écran (Poil de carotte, Désiré Landru), mais c'est surtout avec le cinéma qu'il se fait un nom, partageant l'affiche avec les plus grands, avec notamment, en 2003, le rôle du fils de Jacques Villeret dans les Effroyables jardins de Jean Becker. En 2004, il est à l'affiche de Malabar Princess et, surtout, des Fautes d'orthographe, où il joue pour la première fois un premier rôle, donnant la réplique à Carole Bouquet.

En 2005, Damien Jouillerot poursuit son ascension en accompagnant Gérard Darmon dans la comédie Emmenez-moi. L'année suivante, il est l'une des jeunes vedettes du drame choral Les Aiguilles rouges, qui le voit incarner un scout forcé de gravir un dangereux massif avec d'autres garçons.