Enfant, Sami Bouajila découvre le cinéma en compagnie de son père, d'origine tunisienne, et de son frère. Attiré très tôt par le métier d'acteur, il intègre le Conservatoire Régional de Grenoble et le Centre dramatique de Saint-Etienne, avant de jouer sur les planches du Shakespeare, du Marivaux ou du Koltès.

En 1991, Philippe Galland le fait débuter au cinéma en lui confiant le rôle principal de La Thune, celui d'un ado de banlieue débrouillard et ambitieux. On le retrouve ensuite à l'affiche des Histoires d'amour finissent mal... en général, premier opus d'Anne Fontaine en 1993, et des Silences du palais de Moufida Tlatli, mais c'est dans Bye-bye de Karim Dridi en 1995 que le talent du comédien, entre douceur et intensité, éclate véritablement. S'il tente une incursion hollywoodienne avec Couvre-feu (1998), dans lequel il campe un terroriste palestinien traqué par Denzel Washington, l'acteur choisit le plus souvent de tourner avec de jeunes auteurs (Nos vies heureuses).

En 2000, Sami Bouajila trouve des rôles marquants dans deux longs métrages salués par la critique : séropositif optimiste dans le road movie gay Drôle de Félix, il incarne Jallel, le candide sans-papiers de La Faute à Voltaire, coup d'essai d'Abdel Kechiche. S'il interprète encore un garçon en galère dans Vivre me tue, l'acteur, refusant les clichés liés à la jeunesse immigrée, ne cesse d'élargir son répertoire : tendre amant dans La Répétition et Embrassez qui vous voudrez, travesti dans Change-moi ma vie, il passe sans complexe du film d'action (Nid de guêpes, 2002) au cinéma de Desplechin (Léo en jouant "Dans la compagnie des hommes").

Loin de renier sa culture, il participe à Indigènes, film de guerre sur les soldats nord-africains mobilisés en 1943, pour lequel il obtient en 2006 à Cannes un Prix d'interprétation partagé avec ses frères d'armes. L'année suivante, Bouajila, devenu un acteur de premier plan, se révèle aussi crédible en flic tourmenté chez Téchiné (Les Témoins, film pour lequel il remporte le César du Meilleur second rôle) qu'en gangster dans le polar grand public Le Dernier gang. Toujours en 2007, le comédien donne à nouveau la réplique à Benoît Magimel dans 24 mesures, un drame réalisé par Jalil Lespert, où les destins propres à quatre personnages vont se croiser le temps d'une nuit mouvementée...

Après avoir été à l'affiche des thriller Le Premier cercle (avec Jean Reno) et La Sainte Victoire (avec Clovis Cornillac), Sami Bouajila change de registre en jouant dans Le Siffleur de Philippe Lefebvre, une comédie dans laquelle il côtoie François Berléand et Thierry Lhermitte. En 2010, il retrouve le Festival de Cannes, le réalisateur Rachid Bouchareb et les comédiens Jamel Debbouze et Roschdy Zem dans Hors-la-loi, un film centré sur la guerre d'Algérie, quatre ans après Indigènes. La même année, il figure au générique du nouveau film de Pierre Salvadori, De vrais mensonges, avec Audrey Tautou et Nathalie Baye.

En 2011, il interprète Omar Raddad dans Omar m'a tuer, un film réalisé par son compère Roschdy Zem, sur l'affaire judiciaire la plus médiatisée des années 1990. Un rôle fort plébiscité par la critique. Alternant films sombres (Carré blanc, Ce soir je vais tuer l'assassin de mon fils, Orage) et comédies (Du goudron et des plumes, Divin enfant), l'acteur campe dans Good Luck Algeria (2016) un fils d'algérien se lançant dans un pari fou : se qualifier aux Jeux d'hiver dans la discipline du ski de fond.

Aimant jouer dans des films de gangsters, comme ses prestations dans Braqueurs (2016), Lukas (2018), Paradise Beach (2019) et La Terre et le sang (2020, Netflix) en témoignent, Sami Bouajila revient en 2020 au drame avec Un fils, où il campe un Tunisien dont le fils est blessé lors d'une attaque terroriste. Un rôle qui lui vaut le Prix Orizzonti du meilleur interprète masculin au Festival de Venise ainsi que le César du meilleur acteur. Parallèlement, il participe à la mini-série Souviens-toi et se glisse pour l'occasion dans la peau d'un inspecteur de police qui tente d'élucider une affaire sordide.

Tournant à un rythme régulier, Sami incarne le père de Zita Hanrot dans le thriller écologique Rouge et un homme souffrant d'un traumatisme crânien le poussant à dire les quatre vérités à sa famille dans Les Miens. En parallèle, il trouve deux rôles importants dans des séries criminelles : Braqueurs et Les Papillons noirs.