Fils de stylistes, Gaspard Ulliel tourne dans le téléfilm Une femme en blanc alors qu'il est encore au collège. C'est pourtant à la réalisation que se destine l'adolescent, qui, après quelques stages d'été au cours Florent, étudie le 7e art à l'Université de Saint-Denis. En 1999, il tourne dans un court métrage de Marina De Van, Alias, mais c'est grâce au téléfilm Julien l'apprenti de Jacques Otmezguine, qu'il est remarqué en 2000. L'année suivante, il tient un petit rôle dans Le Pacte des loups de Christophe Gans.

Gaspard Ulliel est révélé en 2002 par Michel Blanc qui lui confie le rôle d'un adolescent titillé par ses hormones dans la comédie chorale Embrassez qui vous voudrez. André Techiné choisit ensuite le jeune acteur au physique androgyne pour incarner le garçon sauvage qui traverse les routes de la France occupée avec Emmanuelle Béart dans Les Egarés. Pour ces prestations à fleur de peau, Ulliel est nommé à deux reprises au César du Meilleur espoir masculin en 2003 et en 2004. Mais c'est la troisième fois qui sera la bonne : le comédien décroche cette statuette en 2005 grâce à Un long dimanche de fiançailles de Jean-Pierre Jeunet, dans lequel il incarne Manech, le fiancé d'Audrey Tautou.

Devenu un acteur de premier plan, Gaspard Ulliel est choisi pour incarner le valeureux paysan Jacquou Le Croquant (2005) puis le terrifiant Hannibal Lecter dans le film qui conte les jeunes années du serial killer. Egalement à l'affiche de films plus intimistes (Le Dernier jour, La Troisième partie du monde), il est dirigé par Gus Van Sant à l'occasion d'un court métrage réalisé pour le film Paris, Je T'aime. Son éclectisme ne se dément pas puisqu'en 2009, on le retrouve en fils d'Isabelle Huppert dans Un barrage contre le Pacifique, adaptation du roman de Duras par Rithy Panh, mais aussi en rejeton de Jean Reno dans le thriller Le Premier cercle.

Ulliel se dirige vers Jérusalem cette même année, là où l'Ultimatum précédant la (première) Guerre du Golfe vient rendre plus complexe une histoire d'amour, déjà violente, avec Jasmine Trinca. En compétition à Cannes huit ans après Les Egarés, on le découvre en pleine lutte amoureuse, au 16ème siècle, dans La Princesse de Montpensier, aux côtés d'un casting élégant (Mélanie Thierry, Lambert Wilson ou Grégoire Leprince-Ringuet) et sous la houlette de Bertrand Tavernier.

En 2011, il est le seul acteur recruté en casting dans la romance chorale L'Art d'aimer d'Emmanuel Mouret. Puis il joue chez Brigitte Roüan dans le méli-mélo hellénique Tu honoreras ta mère et ta mère (2013), où il campe le rôle de Bathazar, fils de Nicole Garcia et sorte de Dieu grec à la beauté sans pareil. Il se plie ensuite pour la première fois à l'exercice du doublage de voix à l'occasion du film d'animation Les Cinq légendes dans lequel il double le héros Jack Frost.

Sa silhouette souple et sa proximité avec le milieu de la mode (ses parents sont stylistes) font de lui l'acteur idéal pour camper le Saint Laurent (2014) de Bertrand Bonello, qui le choisit pour enfiler le costume du couturier, aux côtés Jérémie Renier et Léa Seydoux. Il glane une nomination au César du meilleur acteur pour sa performance. Le comédien s'illustre ensuite dans La Danseuse aux côtés de Soko et accède à la consécration en 2016 avec Juste la fin du monde de Xavier Dolan. Ce rôle poignant d'un écrivain taiseux lui vaut la récompense ultime : le César du meilleur acteur.

En 2018, il est à l'affiche de pas moins de quatre longs-métrages : Eva, de Benoît Jacquot, dans lequel il tombe sous le charme d'une mystérieuse femme fatale incarnée par Isabelle Huppert ; le singulier 9 Doigts du cinéaste punk F.J. Ossang ; l'ambitieux Un peuple et son roi qui nous plonge en pleine Révolution française ; le film de guerre atmosphérique Les Confins du monde de Guillaume Nicloux. 

A l'affiche du drame Sibyl de Justine Triet en 2019, il apparaît deux ans plus tard au casting de la série Marvel Moon Knight, aux côtés d'Oscar Isaac et de Ethan Hawke. Pour l'occasion, il interprète le dénommé Anton Mogart, alias Midnight Man.

Le 19 janvier 2022, après avoir été hospitalisé la veille en urgence après un accident de ski, il décède des suites de ses blessures — il souffrait d'un traumatisme crânien important — à l'âge de 37 ans. Quelques mois plus tard, il apparaît de manière posthume dans deux films : l'expérimental Coma de Bertrand Bonello, dans lequel il double une poupée, et le délicat Plus que jamais, où il est le compagnon d'une femme atteinte d'une maladie incurable.