Né de l’union de Robyn et du docteur Rodney Spencer, le jeune Jesse est le troisième de leurs quatre enfants. Dès son plus jeune âge, il apprend à jouer du violon et nourrit une passion pour la comédie. Ainsi, à 12 ans, il participe à sa première comédie musicale "Anna et le Roi", où il campe le personnage de Louis. L’année suivante, il retrouve les planches pour donner corps à Christopher Robin dans la pièce de théâtre "Winnie l’ourson". Puis, en 1993, il se produit au Princess Theater de Melbourne pour "Scrooge".

Scolarisé dans un établissement privé, Jesse Spencer passe les auditions pour intégrer en 1994 le soap australien Neighbours. Il obtient le rôle de Billy Kennedy. Pour autant, il poursuit ses études considérant alors le métier d’acteur comme un passe-temps. De plus, à l’instar de ses frères et sœur, il souhaite se diriger vers des études de médecine, son père lui ayant transmis le goût pour la discipline. En 1997, il décroche son diplôme mais arrête ses études, bien qu’il ait été accepté en faculté de médecine à l’Université de Melbourne. Tout en assurant le tournage de Neighbours, il fait son retour au théâtre durant l’année 1998-1999 : il devient la tête d’affiche de "Peter-Pan", puis de "Jack et le Haricot Magique".

C’est en 2000 qu’il quitte l’Australie et le célèbre feuilleton qui l’a fait connaître pour emménager à Londres, où il vit un temps en colocation avec James McAvoy. Dès lors, il enchaîne les castings et décroche quelques rôles dans des téléfilms, notamment en 2001 dans Destination Londres en compagnie des sœurs Olsen. De retour dans son pays natal en 2003, il prête ses traits à Anthony Fingleton, un champion de natation entre les années 50 et 60, dans le biopic Swimming Upstream. Il participe la même année à Death in Holy Orders, un téléfilm de la BBC en deux parties, acclamé par la critique.

Jesse Spencer se fait véritablement connaître du grand public en 2004, en décrochant le rôle du Dr Robert Chase, un anesthésiste-réanimateur dans Dr House, donnant la réplique à Hugh Laurie. La série médicale devient l'un des plus grands succès du moment. Sur le tournage, il rencontre Jennifer Morrison, qui devient sa compagne à la ville, et avec qui il partage, en 2006, l’affiche d’un direct-to-dvd : Flourish. Le couple se sépare en 2007 sans que cela n’influe sur le tournage du show. Durant cette période, l’acteur s’adonne à son autre passion, la musique, et intègre en temps que violoniste le groupe "Band From TV". Fondé par Greg Grunberg en 2006, celui-ci réunit de nombreuses stars du petit écran, dont Hugh Laurie, Adrian Pasdar, Teri Hatcher…

En mai 2012, Dr House s’achève après 8 saisons. Pour autant, Jesse Spencer ne reste pas inactif puisqu’il figure au casting du film The Girl is in Trouble. Mais surtout il intègre la distribution de la nouvelle série de NBC, Chicago Fire, dans la peau du Lieutenant Matthew Casey. La série suit l’équipe de pompiers de la caserne 51, à partir du moment où ces combattants du feu perdent l’un des leurs. Il tourne en parallèle dans le film musical Skum Rocks!, à l'affiche dans les salles en 2013.