Eli Roth se passionne très tôt pour les films d'horreur : c'est après la vision d'Alien, le huitième passager, alors qu'il a huit ans, qu'il se décide à être réalisateur. Il tourne de nombreux courts en super 8 avec l'aide de ses frères, avant d'intégrer la filière cinéma de l'Université de New-York dont il sort diplômé en 1995. La même année, il co-écrit avec son ami Randy Pearlstein le scénario de Cabin Fever, mais ils n'obtiennent aucun financement. Pendant quatre ans, il vit de petits boulots, et fait notamment de la figuration pour des films. En 1999, il part s'installer à Los Angeles où il y fait la rencontre de David Lynch, dont il devient un temps l'assistant de production en gérant le contenu du site internet du cinéaste.

Le déclic survient en 2001, où il réunit enfin les fonds nécessaires destinés à la réalisation de Cabin Fever. Bénéficiant d'un excellent bouche-à-oreille, le film remporte un succès considérable et devient le plus gros succès de Lions Gate, la maison de production. Il attire aussi l'attention de Quentin Tarantino — dont il avait parodié Reservoir Dogs dans le court-métrage Restaurant Dogs en 1994 — qui décide de le parrainer.

Après avoir créé avec Boaz Yakin et Scott Spiegel Raw Nerve, une société de production spécialisée dans les films d'horreur, il s'attèle en 2005 à la réalisation de Hostel : malgré de très vives polémiques, ce torture porn qui suit des étudiants fêtards piégés par de riches sadiques est un franc succès et le propulse comme l'un des jeunes cinéastes horrifiques à suivre de près. Deux ans plus tard, il livre une suite, Hostel - Chapitre II, ainsi qu'une fausse bande-annonce pour le dyptique Grindhouse Planète Terreur-Boulevard de la mort de Robert Rodriguez et Tarantino. 

La collaboration continue avec ce dernier puisque, outre une apparition dans Boulevard de la mort, il joue en 2009 aux côtés de Brad Pitt dans Inglourious Basterds. Il incarne le sergent Donny Donowitz, alias "l'Ours juif", un chasseur de nazis connu pour mettre à mort ses ennemis à l'aide d'une batte de baseball. Roth réalise également un court-métrage de propagande nazie factice, La Fierté de la nation, censé avoir été orchestré par Joseph Goebbels, que Tarantino insère dans le film.

Après quelques caméos dans Piranha 3D en 2010, dans le documentaire de Seth Rogen sur le ComicCon de San Diego, ou bien dans Rock Forever d'Adam Shankman, il scénarise en 2012 L'Homme aux poings de fer pour RZA. Ce n'est qu'en 2013 qu'il retourne à la réalisation avec The Green Inferno, co-écrit avec Guillermo Amoedo, rencontré sur le tournage d'Aftershock — que Roth a produit, écrit et interprété. Cet hommage à Cannibal Holocaust suit de jeunes militants écologistes qui se retrouvent confrontés à une tribu anthropophage au milieu de l'Amazonie. Eli Roth confirme ici sa réputation de réalisateur de films d'horreur gores et violents. 

Pourtant, il va s'éloigner à partir de 2015 du genre qui l'a fait connaître et s'attèle d'abord à des thrillers, comme c'est le cas avec Knock Knock, un remake de The Seducers de Peter S. Traynor, dans lequel un homme marié voit sa vie détruite en quelques heures par deux jeunes femmes séduisantes, entreprenantes et dangereuses. Il offre pour la première fois le rôle principal à une star, Keanu Reeves, révèle Ana de Armas et y dirige celle qui sera son épouse jusqu'en 2019, la Chilienne Lorenza Izzo, rencontrée sur le plateau de Green Inferno. Il se frotte ensuite au classique Un justicier dans la ville dont il propose un remake, Death Wish, avec Bruce Willis en lieu et place de Charles Bronson. 

C'est avec surprise qu'on le retrouve quelques mois plus tard derrière La Prophétie de l'horloge, un divertissement fantastique familial avec Jack Black et Cate Blanchett, puis en 2021 à la réalisation de FIN, un documentaire engagé sur la protection des requins. Il n'a cependant pas abandonné le genre horrifique et produit en parallèle de nombreuses productions du genre, comme les séries Hemlock Grove, History of Horror et Urban Legend.

En 2023, il revient véritablement à l'horreur et adapte en long-métrage son faux trailer de Grindhouse avec le slasher Thanksgiving : la semaine de l'horreur, un jeu de massacre qui se déroule durant la célèbre fête américaine.