Dès son plus jeune âge, Rose Byrne fait preuve d’un vif intérêt pour le théâtre et la comédie. A l’âge de 8 ans, elle réussit à convaincre ses parents de l’inscrire dans une célèbre école de théâtre en Australie, ce qui lui permet d’être remarquée lors de ses débuts sur les planches par un producteur, qui lui propose son premier rôle au cinéma, dans Dallas Doll aux côtés de Sandra Bernhard. Malgré un échec commercial, Rose Byrne est convaincue qu’elle en fera son métier. Après avoir obtenu un diplôme en art et en littérature anglaise, elle entre à la Sydney Theater Company et obtient le rôle d’Olga dans la pièce d’Anton Tchekhov Les Trois Sœurs, puis le rôle principal de La dispute de Marivaux, et est diplômée du très réputé Institut national d’art dramatique de Sydney, au même titre que Cate Blanchett ou Nicole Kidman. C’est ensuite par le biais de la télévision qu'elle va être révélée au grand public, avec les séries Hartley, coeurs à vif, Fallen Angels et Fréquence Crime.

Très vite, le cinéma lui ouvre ses portes, et son premier succès est le film de Gregor Jordan, Two hands, avec Heath Ledger. Ce film explose le box-office australien au moment de sa sortie en 1999 et devient un classique. Mais l’année suivante, le film My Mother Frank dans lequel elle donne la réplique à Sam Neill et Sinéad Cusack est un échec commercial, malgré de bonnes critiques. Cela ne l’empêche pas, dès l’année suivante, de se voir offrir un rôle principal dans le film surréaliste The Goddess of 1967 de Clara Law, dans lequel elle y interprète une jeune fille aveugle aux secrets troublants, ce qui lui vaut la Volpi Cup de la meilleure actrice au festival de Venise de 2001. En 2002, George Lucas offre à l’actrice le rôle de la suivante de la reine Amidala (Natalie Portman) dans Star Wars : Episode II - L'Attaque des clones. Si la plupart de ses scènes sont coupées au montage, Rose Byrne profite de la notoriété de cette superproduction américaine pour enchaîner les rôles. Elle prouve alors qu'elle excelle dans tous les genres auxquels elle s'attelle, puisque son interprétation dans la comédie australienne The Rage in Placid Lake lui vaut une nomination aux AFI Awards et que son jeu dans le drame Rencontre à Wicker Park, remake américain de L' Appartement, est très largement plébiscité par la critique.

Son premier vrai succès international, elle le connaît grâce au film Troie, dans lequel elle tient le rôle de Briséis, jeune prêtresse d’Apollon sauvée par Achille (Brad Pitt). Malgré ce petit rôle, Rose Byrne s’impose comme la nouvelle actrice d’Hollywood à suivre. L’année 2006 marque le début de sa consécration, d’abord avec l’arrivée de la série Damages sur les écrans, dans laquelle elle tient tête à Glenn Close et qui lui permet d’être nommée à l’Emmy et au Golden Globe deux années consécutives, puis avec le Marie-Antoinette de Sofia Coppola, qui lui offre le rôle de la meilleure amie de la reine. Rose Byrne propose donc une palette de rôles tous différents les uns des autres, allant du thriller à la science-fiction en passant par la comédie. On découvre en effet ses talents comiques dans American Trip de Nicholas Stoller, avant de la retrouver dans le film d'horreur Insidious de James Wan. En 2011, Rose Byrne revient à la comédie en jouant la demoiselle d'honneur un peu garce dans Mes meilleures amies de Paul Feig, après avoir été agent de la CIA dans le préquel X-Men: Le Commencement.

Le blockbuster donne lieu à deux suites et c'est dans le dernier volet, X-Men : Apocalypse, qu'elle reprend son rôle de Moira MacTaggert. Entre temps, Rose Byrne est la compagne de Patrick Wilson dans l'horrifique Insidious : Chapitre 2 et celle de Seth Rogen dans la comédie déjantée Nos pires voisins. Deux films qui cartonnent au box-office.