Fils de Donald Sutherland et de l'actrice canadienne Shirley Douglas, Kiefer Sutherland se destine très tôt à la carrière de comédien et tient son premier grand rôle dans Throne of straw à l'Odyssey Theatre de Los Angeles. Après avoir poursuivi son apprentissage dans divers ateliers de Toronto, au Canada, il débute à l'écran aux côtés de son père dans Max Dugan returns (1983) de Herbert Ross, puis tient la vedette d'Un printemps sous la neige (1984), un drame pour lequel il est cité au Genie Award.

Le comédien s'établit alors aux Etats-Unis où il fait sa première apparition à la télévision dans l'épisode "La Mascotte" (1985), réalisé par Steven Spielberg dans le cadre de la série Histoires Fantastiques. La même année, il interprète un déséquilibré mutique dans Trapped in Silence, un téléfilm inédit en France. En 1986, il connaît son premier succès international avec Stand by me de Rob Reiner. Dès lors, il alterne les genres : la comédie avec Génération perdue (1987), le drame sentimental avec Promised Land (id.), le western avec Young guns (1988) et Young guns 2 (1990), ou encore le thriller avec La Disparue (1993). Mais ce sont ses prestations d'étudiant en médecine, aux côtés de sa compagne à la ville Julia Roberts, dans L'Expérience interdite (1990), de lieutenant placé sous les ordres de Jack Nicholson dans Des hommes d'honneur (1992), d'Athos dans Les Trois mousquetaires (1993) et de cow-boy moderne dans Deux Cowboys à New York (1994) qui lui permettent de se faire connaître auprès du grand public.

En 1996, Kiefer Sutherland n'hésite pas à incarner des personnages "détestables" : un violeur récidiviste dans Au-delà des lois, un psychopathe défiguré dans Freeway (id.), un membre du Ku Klux Klan dans Le Droit de tuer ? (id.), puis, quelques années après, le mystérieux interlocuteur de Colin Farrell dans Phone game (2003). En 1997, il met en scène son premier long métrage : La Dernière cavale, un polar qu'il interprète aux côtés de Vincent Gallo. Il poursuit sa carrière de réalisateur en 1999 avec Woman wanted, un drame sentimental dans lequel il s'éprend de Holly Hunter.

Parallèlement, Kiefer Sutherland s'essaie à la science-fiction en s'illustrant dans le sombre Dark City (1998) d'Alex Proyas puis au film de guerre via Chungkai, le camp des survivants (2001). Le genre de prédilection reste pour lui le thriller, comme le démontrent ses rôles dans Point de rupture (1998), dans L'Oeil du tueur (1999) et dans Desert Saints (2002). Le grand public le redécouvre en 2001 en agent névrosé de la Cellule Anti-Terroriste dans la série en temps réel 24 heures chrono. Son personnage nommé Jack Bauer, parfois inquiétant et antipathique, doit sans cesse déjouer des complots terroristes visant à nuire à la sécurité des États-Unis mais aussi à celle du monde entier. Le comédien tiendra ce rôle pendant 8 saisons complètes. Sa prestation lui vaut une reconnaissance publique autant que critique, ainsi que le Golden Globe du Meilleur Acteur. Elle lui permet ainsi d'enchaîner au cinéma avec une petite apparition dans Taking lives, destins violés (2004) aux côtés d'Angelina Jolie et d'Ethan Hawke puis avec un rôle d'enquêteur rattaché aux services secrets américains dans un autre thriller musclé, The Sentinel (2006). En 2008, il tourne sous la direction du français Alexandre Aja dans le film fantastique Mirrors. Deux ans plus tard, après avoir à nouveau prêté sa voix pour un film d'animation (Monstres contre Aliens), l'acteur retrouve Joel Schumacher (avec qui il a collaboré sur Le Droit de tuer ? et Phone Game) pour les besoins du drame social Twelve, où il endosse le rôle du narrateur. En 2011, on le retrouve au casting de Melancholia, un drame apocalyptique mis en scène par le sulfureux Lars von Trier.