Né d'un père directeur de théâtre, John Lithgow est très vite plongé dans le milieu artistique. Dès l'âge de six ans, il joue du Shakespeare sur scène, puis s'intéresse à la peinture durant l'adolescence. Diplomé de Harvard, il étudie à la London Academy of Music and Dramatic Art, travaille pour la Royal Shakespeare Company et devient au fil des ans l'un des acteurs les plus respectés de Broadway.

Au pic de sa popularité scènique, John Lithgow se lance à l'assaut du septième art. Il fait ses véritables débuts en 1976 sous les ordres de Brian De Palma dans Obsession, cinéaste et ami qu'il retrouvera pour Blow out et, surtout, L' Esprit de Caïn. C'est en 1982, avec Le Monde selon Garp et une interprétation d'entraîneur de football transsexuel, qu'il se fait véritablement connaître du grand public.

Un éclectisme impressionnant caractérise la carrière de John Lithgow qui, particulièrement à l'aise dans les rôles de méchants, peut enchaîner avec aisance films de science-fiction (2010), oeuvres musicales (Que le spectacle commence!, Footloose), films de guerre (Memphis Belle), productions familiales (Bigfoot et les Henderson) ou plus dramatiques (Tendres Passions). Le thriller le séduit au début des années 90, lorsqu'il incarne l'adversaire de Sylvester Stallone dans Cliffhanger et qu'il campe un juge dans L' Affaire Pélican.

Au début du nouveau siècle, John Lithgow s'essaie à l'animation, en prêtant sa voix au Lord Farquaad de Shrek. En 2003, il se glisse sous les traits de Blake Edwards pour les besoins du long-métrage Moi, Peter Sellers, dans lequel il donne la réplique à Geoffrey Rush. Il revient au genre musical avec Dreamgirls avant d'apparaître dans la comédie romantique Confessions d'une accro du shopping.