Enfant de la balle, Mathieu Demy apparaît dès son plus jeune âge dans les films de son père Jacques Demy, notamment dans Trois places pour le 26 en 1988, et dans ceux de sa mère Agnès Varda avec L'Une chante, l'autre pas en 1976, Mur, murs en 1980, Documenteurs en 1981 et surtout Kung-Fu Master en 1987, dans lequel il incarne un passionné de jeux vidéo qui trouble Jane Birkin de 25 ans son aînée. En 1993, il campe, dans A la belle étoile de Antoine Desrosières, un jeune homme dont on suit l'éducation sentimentale et donne la réplique à Melvil Poupaud, aux côtés duquel il jouera également dans Combat d'amour en songe (2000) et La Chambre obscure (2000) et qui le dirigera dans son moyen-métrage, Pronobis.

Olivier Ducastel lui offre en 1997 le rôle principal de la comédie musicale Jeanne et le garçon formidable. Sa composition de séropositif se sacrifiant par amour lui vaut des critiques élogieuses. Il s'oriente par la suite vers la comédie, incarnant un trentenaire ayant du mal à faire face à ses responsabilités dans Quand on sera grand (2000), l'ex petit-ami d'Audrey Tautou dans Dieu est grand, je suis toute petite (2001) ou encore un jeune homme lunaire dans Le Nouveau Jean-Claude (2002). Après avoir retrouvé Antoine Desrosières pour Banqueroute en 1999, sa route croise en 2001 celle du réalisateur Benoît Cohen, qui le fait figurer au casting du satirique Acteurs anonymes puis de ses opus suivants, Nos enfants chéris (2002) et Qui m'aime me suive (2005), où l'acteur joue un trentenaire renonçant à tout pour vivre de sa passion, la musique.

Toujours enclin à tenir des rôles éclectiques, Mathieu Demy s'essaye également au drame, jouant aux côtés de Simon Abkarian dans Aram (2002), endossant le rôle d'un scientifique obsédé par le mouvement dans Mister V. (2002), ou tournant sous la direction d'Orso Miret pour Le Silence (2004). Il figure également au casting du policier Les Marchands de sable (2000) de Pierre Salvadori et donne la réplique à Emilie Dequenne dans le thriller Ecoute le temps (2005).

Suivant les pas de ses parents réalisateurs, Mathieu Demy passe derrière la caméra pour deux courts métrages dont il est scénariste. En 2000, il signe avec Le Plafond l'adaptation d'une nouvelle de Tonino Benacquista intitulée Requiem contre un plafond : son court métrage est primé dans de nombreux festivals, dont ceux d'Angers, Pantin, Rennes, Dignes et Mamers. Il réalisera par la suite La Bourde (2005), une comédie dramatique située dans un restaurant, pour laquelle il s'offre le rôle principal.

Il revient alors à ses premières amours : l'actorat. En 2007 et 2008, Mathieu Demy reprend le rôle de Martin pour l'adaptation télévisée du film Nos enfants chéris, pour deux saisons diffusées sur Canal +. Cela ne l'empêche pas de tourner en parallèle dans Le Temps d'un regard, film sur l'errance nocturne à Paris, et dans lequel il devient Antoine, un jeune homme qui décide subitement de quitter son travail. On le voit également en 2008 à l'affiche du Grand alibi de Pascal Bonitzer et de Lisa et le pilote d'avion, film pour lequel il retrouve Philippe Barassat, huit ans après leur collaboration sur Folle de Rachid en transit sur mars (2000). Dans La Fille du RER d'André Téchiné, il retrouve Emilie Dequenne et une équipe de renom formée par Catherine Deneuve, Michel Blanc et Nicolas Duvauchelle.

En 2009, il apparaît de nouveau sur le petit écran pour le téléfilm dramatique Mes chères études, qui suit les déboires d'une étudiante contrainte à se prostituer par manque d'argent, et dans lequel il donne la réplique à Déborah François. Deux ans après, Mathieu Demy joue le rôle d'un père attendrissant face à sa petite fille qui joue au garçon dans Tomboy, de Céline Sciamma, puis tient le premier rôle dans la comédie romantique de Guy Mazarguil, dans laquelle il retrouve Julie Gayet dix-sept ans après le film A la belle étoile. 2011 est aussi l'année du premier long de Mathieu Demy en tant que réalisateur et producteur avec Americano. Ce premier film est un road-movie qui aborde les thèmes de l'enfance et du deuil, tourné à Los Angeles et à Paris, dans lequel il dirige Salma Hayek, Géraldine Chaplin et Jean-Pierre Mocky.

Tournant moins pour le cinéma dans les années 2010, l'acteur prend part à la comédie Les Conquérants (2012) et au drame Max et Lenny (2015). Parallèlement, il joue le personnage de Clément Migaud dans la série d'espionnage Le Bureau des légendes. Davantage actif côté petit écran, on le voit aussi dans Ils étaient 10, Mytho, On the Verge et Oussekine. En 2023, il apparaît en second rôle dans les films Rien à perdre et Club Zero.