Barbara Hershey fait ses débuts de comédienne à 17 ans dans les séries télé Gidget et The Monroes. Elle apparaît pour la première fois au cinéma en 1968 dans With six you get eggroll, une comédie familiale avec Doris Day, et enchaîne les seconds rôles. Elle figure ainsi dans le drame On n'achète pas le silence, le dernier film de William Wyler, mais c'est surtout Dernier été, son premier rôle principal, qui va la révéler. Une scène censurée à l'époque et son personnage d'adolescente sexy et manipulatrice suffisent à la faire connaitre du grand public.
En 1969, Hershey joue dans un western, Au paradis à coups de revolver, avec Glenn Ford et David Carradine. Avec ce dernier, elle formera jusqu'en 1975 un couple atypique et rebelle, qui travaillera ensemble sur la série Kung Fu, et deux films réalisés par Carradine : You and Me (1975) et Americana (1983), deux histoires situées au Kansas. Sous la direction de Martin Scorsese, elle donne également la réplique à l'acteur dans Bertha boxcar, qui met en scène la rencontre d'une jeune femme avec un syndicaliste qui va lui enseigner la révolte. C'est sur le tournage de ce film, que Barbara Hershey présente au réalisateur le roman de Nikos Kazantzakis, La Dernière tentation du Christ, que ce dernier adaptera quinze ans plus tard. L'actrice y tiendra le rôle de Marie-Madeleine.
Dans les années 80, sa carrière prend son envol. Alternant les genres, Barbara Hershey s'illustre dans la comédie d'action Le Diable en boîte, le film d'aventure L'Etoffe des héros et le drame Hannah et ses soeurs de Woody Allen. Régulièrement récompensée, elle obtient durant deux années consécutives le Prix de la Meilleure actrice à Cannes pour ses prestations dans Le Bayou en 1987 et Un monde à part en 1988. C'est à la suite du film d'horreur L'Emprise, tourné en 1981 que Michael Douglas la réclame pour lui donner la réplique dans Chute libre. Au cours des années 90, elle se fait plus discrète, mais sa performance dans Portrait de femme aux côtés de Nicole Kidman lui vaut une nomination aux Oscars et aux Golden Globes.
Après des comédies plus ou moins heureuses dont certaines inédites (Breakfast of Champions, Drowning on Dry Land), la France lui ouvre ses portes le temps d'une coproduction, La Fille d'un soldat ne pleure jamais aux côtés de Kris Kristofferson et de Jane Birkin. Elle y joue une expatriée américaine qui quitte la France pour revenir aux États-Unis, et côtoie le célèbre metteur en scène James Ivory. Psychanalyste disparue dans Lantana (2002), elle intègre le casting du film choral 11h14. Son personnage se remet en question après le décès d'une adolescente dans Childless. Elle participe à une adaptation des histoires courtes d'Isaac Bashevis Singer intitulé Love Comes Lately, puis incarne la femme du Dr Schweitzer dans le biopic Albert Schweitzer (2009) avec également Judith Godrèche.
Son rôle-clé de mère possessive voire étouffante dans Black Swan prouve qu'elle n'a pas tout montré de son talent. Barbara Hershey change de cap en apparaissant ensuite dans des films de genre tels que l'horrifique Insidious et le fantastique Answers To Nothing, tourné en 2011 avec Elizabeth Mitchell et Dane Cook.