Diplômé de la Juilliard School à New York et pianiste à ses heures perdues, Kevin Kline intègre la troupe "The Acting Company" en 1972. Après des débuts remarqués au théâtre (où il obtient deux Tony Awards) et une participation au téléfilm The Pirates of Penzance (1980), il quitte New York pour Hollywood. Pour son premier rôle cinématographique, il occupe le haut de l'affiche du Choix de Sophie (1982) d'Alan J. Pakula aux côtés de Meryl Streep, et décroche par la même occasion une nomination aux Golden Globes.

L'année suivante, grâce au film chorale Les Copains d'abord, Kevin Kline entame avec le cinéaste Lawrence Kasdan une fructueuse collaboration qui se poursuivra avec le western Silverado (1985), la comédie Je t'aime à te tuer (1990), le drame Grand Canyon (1991) et la romance French kiss (1995). Dans un genre différent, il se fait le défenseur du leader noir Steve Biko (Denzel Washington) dans Cry freedom (1987) de Richard Attenborough avant de connaître la consécration internationale avec la comédie à succès Un poisson nommé Wanda (1988). Son personnage d'Otto, truand arrogant mais attachant aux côtés de Jamie Lee Curtis, lui vaut l'Oscar du Meilleur acteur dans un second rôle en 1989.

Dès lors, pour le grand public, Kevin Kline demeure indissociable du registre comique comme en témoignent ses prestations sympathiques dans Président d'un jour (1993), Créatures féroces (1997), In & out (1998) et Wild wild west (1999). Mais il n'en reste pas moins actif dans le domaine du thriller (Calendrier meurtrier, 1989 ; Jeux d'adultes, 1992) et s'applique à jouer des rôles à tonalité plus dramatique, contribuant ainsi à la réussite critique de The Ice storm (1997), La Maison sur l'océan (2001) et Le Club des empereurs (2003). Il fait également un détour du côté du cinéma d'animation et prête ainsi sa voix aux héros du Bossu de Notre-Dame (1996) et de La Route d'Eldorado (2000).

En 2004, l'acteur exerce ses talents de pianiste pour interpréter Cole Porter dans De-Lovely, une comédie musicale d'Irwin Winkler retraçant le destin du célèbre compositeur. Dans la même année, il tourne le remake de La Panthère Rose aux côtés de Steve Martin et Jean Reno. Il retrouve en 2006 l'actrice Meryl Streep (avec qui il avait fait ses débuts), dans la comédie dramatique The Last Show, et incarne pour l'occasion un chef de la sécurité.

Oscillant toujours entre films dramatiques et rôles plus légers, Kevin Kline figure au casting du thriller Trade (2007) en tant que policier luttant contre le trafic humain, et interprète un énigmatique professeur d'échec dans le drame français Joueuse (2009). Mais il apparaît également dans la comédie romantique Un jour, peut-être (2008) et prête à nouveau sa voix, pour le film d'animation La Légende de Despereaux (2009). Il participe deux ans plus tard à une nouvelle comédie romantique, donnant ainsi la réplique aux deux Sex Friends : Natalie Portman et Ashton Kutcher, en père dragueur et irresponsable.

Moins connue du grand public que son parcours au cinéma, la carrière de Kevin Kline sur les planches est également remarquable. L'acteur a ainsi été récompensé à maintes reprises pour ses nombreuses interprétations théâtrales, dans des pièces aussi diverses que Henry IV, Hamlet ou encore La mouette.