Fille de la comédienne Catherine Belkhodja, Isild Le Besco fait à 8 ans ses premiers pas à l'écran dans Lacenaire : elle y interprète Hermione, un personnage qu'elle partage avec sa soeur aînée Maïwenn. La jeune réalisatrice Emmanuelle Bercot choisit sur casting cette adolescente aux yeux clairs et au charme insolent, et en fait l'héroïne de ses deux courts, primés dans de nombreux festivals : Les Vacances puis La Puce (1998), qui conte l'initiation sexuelle d'une jeune fille par un homme mûr - quelques années plus tard, Bercot fera de nouveau appel à elle pour Backstage, son deuxième long en 2005.

Isild Le Besco trouve très vite un premier grand rôle dans un long-métrage (Les Filles ne savent pas nager) avant de faire une nouvelle rencontre déterminante, celle de Benoît Jacquot. Celui-ci la dirige aux côtés de Daniel Auteuil dans Sade (avec à la clé une première nomination au César du Meilleur espoir féminin en 2000), et d'Isabelle Adjani dans Adolphe. Puis, tout comme Cédric Kahn, qui en a fait la petite amie du tueur en série Roberto Succo (nouvelle nomination au César en 2001), il exploite le tempérament passionné de l'actrice dans A tout de suite, nouveau récit d'une cavale en 2004. Jacquot et sa muse reprennent la route en 2004 pour L'Intouchable, l'histoire d'une quête identitaire qui les conduit en Inde, et vaut à Le Besco le Prix de la Révélation féminine à la Mostra de Venise en 2006.

L'actrice, qui semble affectionner les jeunes auteurs (Un moment de bonheur, Camping sauvage), sans renier les comédies populaires (Le Coût de la vie, joli succès public), passe derrière la caméra en 2003 en signant Demi-tarif, oeuvre singulière tournée à hauteur d'enfants, et saluée par l'ensemble de la critique. Trois ans plus tard, elle tourne Charly, portrait d'un adolescent interprété par son petit frère Kolia Litscher. Devenue la muse d'un certain cinéma français à l'écart des productions grand public, elle porte avec toujours plus de passion et de finesse les projets Pas Douce, Je te mangerais en 2007 ou The Good Heart (2009) de Dagur Kari.

Après un passage derrière la caméra pour un film à sketchs autour de souvenirs de grands films, intitulé Enfances (2008), Isild Le Besco retrouve son mentor, Benoît Jacquot, dans une variation amoureuse ambiguë intitulée Au fond des bois (2010).