Originaire de Belgique, Jonathan Zaccaï envisage d'abord d'embrasser une carrière de réalisateur, avant de finalement débuter devant la caméra. Après un passage par la publicité et quelques apparitions au cinéma (La Révolte des enfants, 1991) et à la télévision (Cap danger, Sous le soleil), il campe le petit ami insatisfait de Corinne Debonnière dans Petite chérie (2000) d'Anne Villaceque.

Sa carrière lancée, il balade son physique de jeune premier dans Les Déclassés (2001) et Reines d'un jour (id.), et s'illustre dans quelques premiers longs métrages comme Bord de mer (2002) de Julie Lopes-Curval et Le Tango des Rashevski (2003) de Sam Garbarski. Fidèle à ces deux cinéastes, il retrouve la première pour Toi et moi (2005), comédie romantique où il a pour partenaires féminines Marion Cotillard et Julie Depardieu, et le second pour Quartier lointain en 2009.

Le grand public découvre véritablement Jonathan Zaccaï aux côtés d'Agnès Jaoui et Karin Viard dans Le Rôle de sa vie (2004), tandis que la critique salue sa prestation de mort-vivant au regard pénétrant dans Les Revenants (id.) de Robin Campillo. Valeur montante du cinéma français, il partage en 2005 avec Hélène De Fougerolles la tête d'affiche du Plus beau jour de ma vie, une comédie populaire sur le mariage.

Mais c'est dans un registre plus noir que l'acteur excelle. Agent immobilier escroc dans De battre mon coeur s'est arrêté (2005) de Jacques Audiard, il incarne le mari impuissant d'Isabelle Carré dans le thriller intimiste Entre ses mains, un chômeur pour le moins louche dans La Chambre des morts (2007) ainsi qu'un ami de longue date de Guillaume Depardieu dans Les Yeux bandés (2008).

On le retrouve également, toujours aussi troublant, au générique d'Elève libre, drame de son compatriote Joachim Lafosse présenté à la Quinzaine des Réalisateurs à Cannes et pour lequel l'acteur reçoit un Magritte du cinéma (l'équivalent belge des César). En 2010, il est choisi par Ridley Scott pour jouer le roi de France dans Robin des Bois, sa première incursion dans une grosse production hollywoodienne. De retour en France, il incarne le frère de François Cluzet dans le thriller Blanc comme neige avant d'interpréter l'amour d'enfance de Sophie Marceau dans la comédie L' Age de raison.

Depuis le milieu des années 2000, Jonathan Zaccaï se consacre à une nouvelle carrière, celle de réalisateur. Après deux courts métrages (Comme James Dean et Y'a pas de quoi), il écrit et tourne son premier long en 2012, JC Comme Jésus Christ (dans lequel il tient également un rôle secondaire). Cette comédie inclassable suit la vie de JC (Vincent Lacoste), un adolescent réalisateur un brin mégalo. Malgré ce passage à la mise en scène, Jonathan Zaccaï ne délaisse pas pour autant son métier d'acteur. Ainsi, il partage la même année l'affiche de Cornouaille d'Anne Le Ny, avec Vanessa Paradis et Samuel Le Bihan.