Boursier du Centre National des Lettres et créateur de la compagnie théâtrale La Troupe, Guillaume Nicloux débute sa carrière de réalisateur en dirigeant Anémone dans Les Enfants volants (1990) puis Michel Piccoli et Arielle Dombasle dans le téléfilm La Vie crevée (1992), diffusé sur Arte, et enfin Bernard-Pierre Donnadieu et Laura Morante dans Faut pas rire du bonheur (1995). Attiré par les univers singuliers, le polar et l'oeuvre de Jean-Pierre Melville, il met en scène en 1998 Le Poulpe, avec Clotilde Courau et Jean-Pierre Darroussin, et quatre ans plus tard offre à Thierry Lhermitte un rôle à contre-emploi dans Une affaire privée, un film noir salué par la critique.

L'année suivante, c'est un autre membre de la troupe du Splendid, Josiane Balasko, qui se retrouve devant la caméra de Guillaume Nicloux. Celui-ci l'imagine alors en femme flic à la dérive, introvertie et dépressive pour Cette femme-là. Après avoir accepté, avec pertes et fracas, d'adapter à l'écran le roman de Jean-Christophe Grangé, Le Concile de pierre (2006), le cinéaste décide de conclure sa trilogie policière avec La Clé, l'histoire d'un jeune homme, joué par Guillaume Canet, victime d'une machination infernale après avoir accepté de récupérer les cendres de son père défunt.

Fidèle à ses acteurs, Guillaume Nicloux retrouve Jean-Pierre Darroussin et Josiane Balasko, qu'il dirige aux côtés de Judith Godrèche dans le décapant Holiday (2010). Il fait un détour par la télévision en 2012, avec le téléfilm L'Affaire Gordji, histoire d'une cohabitation, dans lequel Thierry Lhermitte incarne Jacques Chirac, Premier ministre confronté à une série d'attentats frappant Paris. Le metteur en scène revient ensuite au cinéma en 2013 avec La Religieuse, adapté du roman de Denis Diderot et mettant en scène une jeune fille (Pauline Etienne) contrainte de rentrer dans les ordres.

L'année suivante, le cinéaste s'engage dans un projet plutôt cocasse, L'enlèvement de Michel Houellebecq, un téléfilm diffusé sur Arte. L'histoire suit le célèbre écrivain français, kidnappé et séquestré par une bande de malfrats. L'intrigue est inspirée de faits (presque) réels, Houellebecq ayant réellement disparu quelques jours en 2011 et suscité une vague d'inquiétudes avant de réapparaître. Le metteur en scène revient sur grand écran en 2015 en dirigeant Gérard Depardieu et Isabelle Huppert dans Valley of Love, l'histoire de deux parents se retrouvant sur les traces de leur fils décédé, dans la Vallée de la mort en Californie.

La rencontre avec Depardieu est déterminante puisqu'il le dirige dans ses trois longs-métrages suivants : l'exercice de style minimaliste The End, sorte de thriller teinté de fantastique dans lequel l'acteur se perd en forêt — le film sort en e-Cinéma, avec la particularité d'avoir été pensé et produit pour sortir sur ce support, sous l'impulsion de la productrice Sylvie Pialat — ; Les Confins du monde, avec Gaspard Ulliel en quête de vengeance dans l'Indochine de 1945 ; et le décalé Thalasso, où Depardieu rencontre Houellebecq en cure.

Le réalisateur fait ensuite un détour par le petit écran : il crée et réalise pour Arte la mini-série Il Etait une seconde fois, où le surnaturel s'immisce dans une histoire d'amour, et signe le documentaire Netflix Les Rois de l'arnaque. 

Toujours là où on ne l'attend pas, Guillaume Nicloux sort en 2023 deux longs-métrages : le radical et oppressant La Tour, et l'émouvant La Petite. Dans le premier, il montre comment les habitants d'une barre d'immeuble, enfermés dans celle-ci, finissent par se livrer à leurs plus bas instincts. Dans le second, il dirige pour la première fois Fabrice Luchini et lui offre un rôle tout en retenue, celui d'un sexagénaire endeuillé qui part à la rencontre de la mère porteuse de son petit-enfant.