Brendan Gleeson est né à Dublin. Dès son plus jeune âge, il est fasciné par la littérature et voue une grande passion pour les auteurs irlandais comme Samuel Beckett. C'est cet intérêt pour le théâtre qui l'amène à faire ses premiers pas en tant qu'acteur au lycée, dans la pièce En attendant Godot. Après avoir obtenu son baccalauréat, il intègre une troupe itinérante, la Dublin Shakespeare Festival, et se produit dans les rues de sa ville natale, en tant que musicien. Parallèlement, il poursuit des études supérieures et devient professeur d'anglais et de gaélique.

Il reste ainsi instituteur pendant près de dix ans, puis sa passion pour la comédie le rattrape. Il part alors tenter sa chance à Londres où il est reçu à la prestigieuse Royal Academy of Dramatic Art dont il sort diplômé trois ans plus tard. Il retourne ensuite sur ses terres natales pendant un temps avant d'être sollicité par la Royal Shakespeare Company à Stratford-upon-Avon. Pendant deux ans, il joue dans plusieurs pièces de théâtre au sein de la prestigieuse compagnie, notamment dans Le Roi Lear et Richard III.

Ce n'est que tardivement, à l'âge de 35 ans, que Brendan Gleeson décide d'entamer une carrière d'acteur au cinéma. Après quelques téléfilms, dont The Treaty (TV), où il incarne la figure du révolutionnaire irlandais Michael Collins, rôle pour lequel il obtient un Jacob's Award en 1992, Gleeson commence à percer dans le cinéma. Il décroche d'abord de petits rôles, dans Horizons lointains de Ron Howard, ou dans Le Cheval venu de la mer, de Mike Newell, mais commence à marquer les esprits en 1995, avec Braveheart, fresque épique de Mel Gibson dans laquelle il incarne Hamish, un guerrier confirmé, puis Michael Collins de Neil Jordan l'année suivante. Alors que son compatriote Liam Neeson y campe le fameux révolutionnaire dans la peau duquel Gleeson s'était glissé quelques années plutôt pour la télévision, ce dernier joue ici le rôle de Liam Tobin, un officier de l'armée irlandaise.

La carrière de Gleeson commence peu à peu à se profiler : très attaché à ses origines gaéliques, il porte un grand intérêt à la mythologie irlandaise et incarne souvent des personnages s'inscrivant dans une tradition celtique. Il joue même du fiddle, instrument traditionnel irlandais, dans Michael Collins et Retour à Cold Mountain.

En 1998, Brendan Gleeson poursuit son ascension : frappé par leur ressemblance physique, John Boorman lui confie le rôle du légendaire gangster irlandais Martin Cahill dans Le Général. Cette prestation très remarquée lui vaut d'être distingué à trois reprises, recevant successivement le Boston Film Critics Award, le London Film Critics Award et l'Irish Film and Television Association Award. Son physique imposant lui permet par ailleurs d'alterner les personnages tantôt autoritaires (shérif dans Lake placid, policier corrompu dans Dark Blue), sympathiques (A.I. Intelligence artificielle, 28 days later) ou rustres (Le Tailleur de Panama, Gangs of New York).

Habitué aux grandes fresques épiques, Brendan Gleeson prête également ses traits au personnage mythologique du Roi Ménélas dans Troie (2004), récit de l'Iliade revisité par Wolfgang Petersen, puis peuple la même année Le Village de M. Night Shyamalan. Après ces deux films américains très lucratifs, il rejoint ses terres natales, pour participer à un court-métrage et à un petit film. Puis, Ridley Scott l'engage pour interpréter un roi fourbe, chevalier de l'ordre des Templiers dans Kingdom of Heaven en 2005, où il retrouve Liam Neeson, avec lequel il tourne donc fréquemment.

Toujours en 2005, il rejoint l'univers magique de Poudlard et se glisse dans la robe de Maugrey Fol-Oeil, nouveau Professeur de Défense contre les forces du Mal dans Harry Potter et la Coupe de Feu de Mike Newell, avec qui il avait déjà travaillé. Il continue d'incarner son personnage jusqu'à la fin de la saga, en 2011. A titre anecdotique, l'un des quatre fils de Gleeson, Domhnall Gleeson, apparaît sous les traits de Bill Weasley dans Harry Potter et les reliques de la mort.

Depuis quelques années, l'acteur s'illustre aussi dans des comédies britanniques toujours très marquées par un certain folklore : ainsi, il donne la réplique à Colin Farrell, irlandais lui aussi, dans Bons Baisers de Bruges en 2008, et s'amuse des clichés qui collent à la peau de son peuple dans un film qui porte bien son nom : L'Irlandais (2011) ! Ne délaissant pas les productions américaines pour autant, il incarne Martin Brown dans Green Zone en 2010, donnant ainsi la réplique à Matt Damon.

Deux ans plus tard, il regagne l'Irlande dans Albert Nobbs, où il joue le Dr. Holloran aux côtés de Glenn Close. Toujours en 2012, Brendan Gleeson migre à nouveau vers les États-Unis, en interprétant le colonel Hamilton dans le biopic revisité d'Egdar Allan Poe, L'Ombre du Mal, aux côtés de l'Américain John Cusack, et est également à l'affiche du thriller d'action Sécurité rapprochée, une sorte de mélange entre La Mémoire dans la peau et Training Day, avec Denzel Washington. Le comédien élargit également ses horizons en s'essayant au doublage pour le film d'animation : Les Pirates ! Bons à rien, Mauvais en tout ; expérience qu'il réitère avec Les Schtroumpfs 2 et Le chant de la mer.

Toujours abonné aux films d'action, Brendan joue dans Edge of Tomorrow aux côtés de Tom Cruise, plonge Au Coeur de l'océan pour Ron Howard et partage l'affiche d'Assassin's Creed avec Michael Fassbender. Il n'en délaisse pas pour autant les productions britanniques : il livre une performance remarquable en prêtre menacé de mort dans Calvary, assume le mauvais rôle face aux Suffragettes Carey Mulligan, Helena Bonham Carter et Meryl Streep, et se retrouve Seul dans Berlin dans le nouveau film de Vincent Perez. Il retrouve Fassbender dans le drame sur une famille de hors-la-loi A ceux qui nous ont offensés, donne la réplique à Isabelle Huppert dans Frankie et campe le roi Duncan dans The Tragedy of Macbeth.

Héros de la série policière Mr Mercedes et dans la peau de Donald Trump dans The Comey Rule, le natif de Dublin refait équipe en 2022 Martin McDonagh et Colin Farrell pour le drame Les Banshees d'Inisherin. Il sera également à l'affiche de la tant attendue suite de Joker avec Joaquin Phoenix.