Benicio Del Toro nait à Porto Rico, de deux parents avocats, et déménage, à l'âge de douze ans, aux Etats-Unis. Après le lycée, il commence des études en économie à l'Université de San Diego qu'il finit par abandonner pour entamer une formation de comédien. Il étudie d'abord au Conservatoire de Stella Adler à Los Angeles puis dans la prestigieuse Circle in the Square Theatre School de New York. Il commence sa carrière à la télévision et après de rapides apparitions dans plusieurs séries, dont un épisode de Deux flics à Miami, et dans Big top Pee-wee (1988), l'acteur incarne un homme de main aux prises avec James Bond dans Permis de tuer (1989). A 21 ans, il devient ainsi le plus jeune adversaire jamais opposé à l'agent 007.

Dès lors, il enchaîne les petits rôles dans des oeuvres s'éloignant de la grosse machinerie hollywoodienne : The Indian runner (1991), la première réalisation de Sean Penn qui fera de nouveau appel à lui, dix ans plus tard, pour The Pledge, Etat second (1993) de Peter Weir, le corrosif Swimming with sharks (1994) et Usual suspects (1995) de Bryan Singer qui le révèle au grand public en gangster maniéré.

Hormis une participation au Fan (1997) de Tony Scott, Benicio Del Toro reste fidèle au cinéma indépendant en s'illustrant dans Basquiat (1996) de Julian Schnabel et Nos funérailles (id.) d'Abel Ferrara. S'impliquant totalement dans ses rôles, il va jusqu'à prendre une vingtaine de kilos pour interpréter le compagnon de route du journaliste Raoul Duke (Johnny Depp) dans le Las Vegas Parano (1998) de Terry Gilliam. Faisant figure de Sean Penn latin, il aime à entourer sa personnalité de mystère et à accepter des rôles peu "bavards" comme ceux du gangster "dessoudé" Franky Four Fingers de Snatch (2000), du kidnappeur dépassé par les événements de Way of the gun (id.) et du soldat converti en tueur de Traqué (2003).

La consécration arrive en 2001 avec Traffic de Steven Soderbergh : sa prestation de policier mexicain désabusé lui vaut l'Oscar et le Golden Globe du Meilleur second rôle masculin, l'Ours d'argent du Meilleur acteur au Festival de Berlin et une multitude d'autres récompenses. Très convoité à Hollywood, Benicio Del Toro fait le choix de ne tourner qu'avec parcimonie, portant son dévolu sur des projets originaux et risqués comme Sin City (2005) et des personnages de marginaux (ex-taulard dans 21 grammes, héroïnomane dans Nos souvenirs brûlés).

En 2009, Benico Del Toro se glisse dans la peau du Che au sein d'un biopic composé de deux longs-métrages mis en scène par Steven Soderbergh. Pour la seconde fois aux côtés du réalisateur, il obtient le prix d'interprétation masculine lors du Festival de Cannes 2008. Malheureusement, et ce malgré l'investissement du comédien, les deux films sont des échecs cuisants au box office, tout comme Wolfman deux ans plus tard. Aucunement découragé mais se faisant plus rare sur grand écran, Benico Del Toro passe derrière la caméra de l'un des segments de 7 jours à la Havane, présenté en sélection Un Certain Regard au Festival de Cannes 2012, pour ensuite rejoindre Oliver Stone dans Savages, un film dont les thématiques centrales (cartels et trafic de drogue, etc.) ne sont pas nouvelles pour le comédien.

L'année suivante, Benicio del Toro revient à Cannes pour présenter Jimmy P, drame autobiographique du Français Arnaud Desplechin pour lequel, sous les traits du vétéran nord-amérindien Jimmy Picard, il suit une intense psychothérapie menée par un ethnopsychiatre philanthrope campé par Mathieu Amalric. En 2014, on l’aperçoit, méconnaissable, dans la superproduction Marvel, Les Gardiens de la Galaxie, où il prête les exceptionnelles qualités d’acteur qu’on lui sait au personnage du Collectionneur. Il défend ensuite le thriller Paradise Lost où il campe ni plus ni moins que Pablo Escobar...

En 2015, Benicio del Toro participe à nouveau à un film parlant des cartels de drogue. Avec le violent Sicario de Denis Villeneuve, l'acteur se glisse dans la peau d'un ancien procureur qui, suite à l'assassinat de sa famille, est lui-même devenu un tueur dans le but de traquer les trafiquants... Parallèlement aux blockbusters Star Wars: Episode VIII - Les derniers Jedi (2017) et Avengers : Infinity War (2017) dans lesquels il apparaît, Benicio del Toro reprend ce rôle intéressant dans Soldado, la suite de Sicario entièrement dédiée à ce personnage.