Issu de l'université new-yorkaise de Purchase (spécialisée dans les arts visuels), Stanley Tucci se fait une spécialité, tout au long de sa carrière, des personnages d'Italo-Américains durs à cuire. Après une première apparition dans L'Honneur des Prizzi de John Huston (1985), aux côtés de Jack Nicholson, il continue à jouer les seconds couteaux de comédies, dans Who's That Girl, avec Madonna, ou le populaire Beethoven (1992). Il joue aussi bien pour Woody Allen (Harry dans tous ses états) que pour Danny Boyle (Une vie moins ordinaire), et obtient quelques rôles plus importants, notamment dans L'Affaire Pélican, dans lequel il interprète Khamel, un assassin venu de l'Est, ou Kiss of Death, où il est Frank Zioli, un procureur malhonnête.
En 1996, ce grand second rôle du cinéma américain co-réalise (avec l'acteur Campbell Scott), scénarise et produit son premier film, Big night, qu'il présente au festival du film indépendant de Sundance. Stanley Tucci tient également le rôle principal de cette comédie sur les déboires de deux frères italiens voulant sauver leur restaurant de la faillite. Son second long métrage, The Impostors, en 1998, est également une comédie dans la pure tradition des films de Laurel & Hardy, dans laquelle il partage l'affiche avec Oliver Platt.
Stanley Tucci n'abandonne pas pour autant sa carrière d'acteur, et complète son palmarès de seconds rôles avec des films comme Le Songe d'une nuit d'été ou Couple de stars. Il retourne derrière la caméra en 2000 avec Joe Gould's secret (drame basé sur la véritable amitié entre un journaliste et un vagabond dans les années 40 et 50) mais c'est surtout en tant qu'acteur qu'il continue de tracer sa voie durant cette décennie. Toujours très sollicité, il apparaît dans des productions de plus en plus importantes. Il tourne notamment sous la direction de Sam Mendes (Les Sentiers de la perdition), Steven Spielberg (Le Terminal) et Peter Jackson (Lovely Bones) et devient populaire sur le petit écran grâce à son rôle du Docteur Moretti dans la série Urgences. Il s'illustre également dans de nombreuses comédies telles que Le Diable s'habille en Prada en bras-droit de Meryl Streep, Easy Girl où il est le père d'Emma Stone et Julie et Julia de Nora Ephron.
Si les années 2010 s'ouvrent avec le musical Burlesque et le drame Margin Call, c'est surtout dans des superproductions hollywoodiennes qu'évolue le comédien par la suite. Il recrute ainsi Chris Evans pour faire de lui Captain America (2011), présente à quatre reprises les Hunger Games (2012) dans un look totalement extravagant, prête ses traits à Dionysos dans Percy Jackson (2013) ou encore se frotte aux robots géants de Transformers dans L'âge de l'extinction et The Last Knight. Il se retrouve même transformé en clavecin dans l'adaptation live de La Belle et la bête (2017).
Entre deux blockbusters, il est au générique de quelques oeuvres plus modestes comme Les Jardins du Roi (2015) de son collègue Alan Rickman, l'Oscarisé Spotlight (2016) et My Lady (2018) où il est le compagnon d'Emma Thompson. Toujours prompt à multiplier les expériences dans des domaines variés, il prête sa voix dès 2014 à Herb Kazzaz, l'ex-mentor et meilleur ami de BoJack Horseman, le héros de la série animée Netflix du même nom. Autre série, autre ambiance en 2017 avec la saison 1 de Feud qui retrace la rivalité légendaire entre Joan Crawford et Bette Davis. Il y est Jack Warner, le célèbre président de la Warner Bros. En 2018, il revient à la réalisation plus de dix ans après Blind Date, resté inédit en France. Avec Alberto Giacometti, The Final Portrait, il signe un biopic consacré à l'un des peintres et sculpteurs les plus importants du XXème siècle.