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Cadette d'une fratrie de cinq enfants, Sarah Polley est la fille d'un acteur et d'une directrice de casting. Après avoir fait ses débuts à l'écran à 5 ans dans One magic Christmas, une production Disney, elle campe en 1988 la fillette butée des Aventures du baron de Munchausen de Terry Gilliam. Devenue très populaire dans son pays grâce à son rôle dans Road to Avonlea, une série canadienne à succès, celle qui a perdu sa mère à 11 ans et quitté le domicile familial à 14 ans ne tarde pas à briser son image consensuelle en se consacrant, adolescente, à l'activisme politique.

Sarah Polley accède à la reconnaissance internationale en 1997 grâce à De beaux lendemains de son compatriote Atom Egoyan (avec qui elle avait déja tourné Exotica), et dans lequel elle incarne, avec un subtil mélange de douceur et de lucidité, la seule survivante d'un accident de car. Bientôt dirigée par un autre illustre Canadien, David Cronenberg (eXistenZ en 1999), elle prend part à des oeuvres audacieuses et troubles comme Le Poids de l'eau de Kathryn Bigelow en 2000 ou le romantique Guinevere, affichant une prédilection pour les auteurs indépendants (Winterbottom, Hal Hartley).

Actrice exigeante, Sarah Polley ne refuse cependant ni la comédie (Go de Doug Liman), ni le cinéma de genre, comme en témoigne sa participation à L'Armée des morts (2004), remake du film d'épouvante de Romero. En 2003, elle reçoit tous les éloges pour sa composition de mère de famille condamnée par la maladie dans Ma vie sans moi, sobre mélodrame de l'Espagnole Isabel Coixet, qui la dirigera de nouveau trois ans plus tard dans The Secret life of words. En 2005, on ne s'étonne pas de retrouver l'actrice au sourire mélancolique dans l'univers nostalgique de Wim Wenders (Don't come knocking). Auteur de plusieurs courts métrages depuis la fin des années 90, elle réalise ensuite son premier long, Loin d'elle avec Julie Christie dans le rôle d'une femme atteinte de la maladie d'Alzheimer.

L'actrice continue de faire des choix surprenants en matière de cinéma, elle est ainsi à l'affiche du film expérimental de Jaco van Dormael, Mr. Nobody, aux côtés d'un autre abonné du cinéma indépendant, Jared Leto. En 2010, elle incarne une scientifique qui dépasse les frontières de l'éthique et de la morale dans le dérangeant Splice de Vincenzo Natali où elle a pour partenaire Adrien Brody, avant de sortir son second long-métrage Take This Waltz, prévu pour 2011.