Jensen Ackles débute très tôt en posant pour des publicités dès l'âge de 4 ans. Pourtant, en grandissant, c'est dans le base-ball qu'il pense faire carrière. Cependant, sa participation à une pièce de théâtre au lycée va l'amener à changer ses projets. Conquis, Jensen Ackles prend des cours d'art dramatique et s'installe à Los Angeles.

En 1997, il décroche le rôle d'Eric Brady dans le soap Des jours et des vies. Très apprécié des téléspectatrices, il passe 3 années à se perfectionner dans cette série avant de tenter sa chance ailleurs. Après s'être fait remarquer en participant à un épisode de Dark Angel (1.18 Prédateur), la production le rappelle quelques mois plus tard pour lui proposer le rôle régulier d'Alec. Il intègre alors le casting régulier de Dark Angel pour la 2ème saison.

Une fois la série annulée, le jeune homme fait quelques apparitions dans la dernière saison de Dawson, puis rejoint l'équipe de Smallville à la rentrée 2004 pour jouer le nouveau petit ami de Lana Lang dans la saison 4.