La 25e heure est tiré du premier roman de David Benioff, publié en 2001 sous le titre 24 heures avant la nuit.
Spike Lee, pour qui New York est un véritable personnage de La 25e heure, n'a pas souhaité ignorer les évènements tragiques du 11 septembre : "Quand on me demande de quoi parle La 25e heure, je réponds qu'Edward Norton joue un dealer qui passe ses dernières 24 heures de liberté dans le New York d'après le 11 septembre (...). Même si le roman et le scénario ont été écrits avant le 11 septembre, nous savions qu'il fallait inclure l'évènement dans le film. Il ne s'agissait pas d'être démonstratifs mais d'inclure cette nouvelle réalité dans le climat, dans le décor. Ignorer ce qui s'est passé et ce que cela a changé dans la ville est impossible. Ne pas en tenir compte, ne pas le présenter dans le contexte aurait été au moins une erreur, au pire un mensonge. Nous avons intégré les conséquences de cette tragédie au scénario, et c'est devenu un élément qui a été incorporé à la photo et même dans le dialogue".
Le film a été tourné dans les cinq grands quartiers de la ville de New York : à Brooklyn, dans le Queens, à Staten Island, dans le Bronx et à Manhattan.
La musique du film composée par Terence Blanchard a été enregistrée à Londres, grâce à un orchestre de 80 personnes du Royal Philarmonic Orchestra et du London Symphonic Orchestra.
De nombreux collaborateurs de Spike Lee le suivent de film en film. Pour La 25e heure, il a profité de sa chef costumière Sandra Hernandez, déjà à ses côtés pour Get on the Bus et Girl 6 en 1996, puis pour He Got Game en 1998. Il a également retrouvé le chef monteur Barry Alexander Brown, qui avait assuré le montage de School Daze en 1988, puis Do the right thing (1989), Malcolm X (1992), Crooklyn (1994) et Summer of Sam (1999). Enfin, Spike Lee a une nouvelle fois confié la musique du film au compositeur Terence Blanchard, qui l'a suivi dès 1990 pour Mo' Better Blues, puis Jungle Fever (1991), Malcolm X (1992), Crooklyn (1994), Clockers (1995), 4 little girls (1997) et enfin Summer of Sam en 1999.
La jeune actrice Anna Paquin retrouve pendant le tournage de La 25e heure le comédien Philip Seymour Hoffman, qu'elle avait déjà croisé en 2000 pour Presque célèbre de Cameron Crowe.
Spike Lee confie s'être intéressé à l'acteur Barry Pepper depuis qu'il l'a vu évoluer dans Il faut sauver le soldat Ryan en 1998. Il a voulu rencontrer l'acteur pour un rôle dans La 25e heure, et a donc dans ce but organisé une rencontre au Madison Square Garden de New York, lors d'un match de basket-ball entre l'équipe locale des Knicks et les Raptors de Toronto, mais les deux hommes n'ont fait que parler du film.
Le comédien Tobey Maguire a connu à l'occasion du tournage de La 25e heure, sa première expérience en tant que producteur. L'interprète de Spider-Man s'est également attelé depuis à la production exécutive de son prochain long métrage, le drame Seabiscuit.
Les deux acteurs Edward Norton et Philip Seymour Hoffman ont tourné deux fois ensemble en 2002, la première dans Dragon Rouge où ils n'avaient pas beaucoup de scènes ensemble, puis dans La 25e heure sous la direction de Spike Lee.
Spike Lee a fait appel à la comédienne Rosario Dawson pour incarner Naturelle, la petite amie d'Edward Norton dans La 25e heure. Il l'avait auparavant dirigée dans He Got Game en 1998.
Lors de la scène de la bagarre, le comédien Barry Pepper a cassé accidentellement le nez d'Edward Norton.
Le réalisateur américain Spike Lee explique ce qui l'a poussé à s'intéresser au scénario de La 25e heure : "J'ai tout de suite été sensible au sujet, à sa force, ses paradoxes, son humanité aussi. C'est une histoire qui donne à penser et à ressentir. Elle se déroule comme un compte à rebours sur 24 heures et cela me séduisait. Cela renforce l'intensité et concentre les choix sur une courte période.". Concernant le personnage principal, interprété par Edward Norton, il ajoute : "Je ne choisis jamais les films que je réalise sur le caractère sympathique ou non des protagonistes. Monty Brogan est un dealer, et bien sûr, cela le rend antipathique aux yeux de l'immense majorité des gens. Pourtant, les individus les moins recommandables font souvent les meilleurs personnages, ils ont parfois des destins captivannts et tragiques. J'aime chercher ce qu'il y a de bon dans ce qui semble mauvais. Le paradoxe de l'être humain est fascinant".
Avant même que le roman dont est tiré La 25e heure ne paraisse dans le commerce, le comédien Tobey Maguire et la société de production Industry Entertainment avaient déjà acheté les droits du livre. Ce sont ensuite les producteurs du projet qui ont proposé à l'auteur David Benioff d'adapter pour le cinéma son roman.