Lorsque le projet en était à ses débuts, plusieurs grandes actrices ont été pressenties pour se glisser dans la peau de Cassandra Web. Parmi elles, il y avait Charlize Theron, Amy Adams et Dakota Johnson. Finalement, Sony Pictures Entertainment a jeté son dévolu sur la dernière, célèbre notamment pour son personnage de Anastasia Steele dans la lucrative saga érotique Cinquante Nuances de Grey.
Madame Web appartient au Sony's Spider-Man Universe (SSMU), qui met en scène des personnages et histoires issus des comics Marvel, en particulier ceux centrés sur Spider-Man, comme l'indique son nom. Les films issus du SSMU sont produits par Columbia Pictures en association avec Marvel Entertainment, et distribués par Sony Pictures Releasing. Le SSMU se développe en parallèle du Marvel Cinematic Universe (MCU). Outre Madame Web, les longs-métrages appartenant au SSMU sont pour l'instant Venom et ses suites, Morbius, et Kraven, prévu pour août 2024. D'autres films sur Hypno-Hustler, Spider-Woman et El Muerto sont en projet.
Dans les comics, le personnage de Cassandra Webb est apparu pour la première fois en novembre 1980 dans le numéro 210 de The Amazing Spider-Man. Elle est atteinte de myasthénie, maladie neuromusculaire auto-immune qui la rend aveugle et paralysée. Mais elle survit grâce à l'appareil de soutien conçu par son mari : une série de tubes en forme de toile d'araignée auxquels elle est reliée.
C'est depuis ce trône vital qu'elle peut aider Spider-Man, dont elle devient l'alliée et la protectrice, grâce à ses pouvoirs mentaux : télépathie, clairvoyance et capacité à prédire l'avenir. Elle peut notamment projeter ses pensées dans l'esprit d'autres personnes, mais également voir des événements passés et présents auxquels elle n'a pas forcément assisté.
Tahar Rahim incarne Ezekiel Sims. Apparu pour la première fois dans les comics en 2001 dans le numéro 30 de The Amazing Spider-Man, il s'agit d'un homme d'affaires doublé d'un explorateur, qui a acquis des pouvoirs similaires à ceux de Peter Parker lors d'un rituel avec des araignées au Pérou. Il s'en sert uniquement pour lui-même et l'empire qu'il bâtit, et non les autres. S'il est l'antagoniste principal du long métrage, son personnage n'est pas toujours méchant dans les comic books.
Madame Web marque la première incursion du comédien français dans un film de super-héros américain.
S.J. Clarkson a été choisie pour être aux commandes de la mise en scène de Madame Web. Si, pour l'occasion, la cinéaste signe son premier film pour le cinéma, elle possède une longue et riche expérience du côté des séries télévisées. Pour preuve, elle a réalisé des épisodes de Life on Mars, Dexter, Ugly Betty, Dr House, Bates Motel, Orange Is the New Black, Vinyl, The Defenders, Collateral, Succession ou encore Anatomie d'un scandale. On lui doit aussi le téléfilm Toast (2010), avec Helena Bonham Carter et Freddie Highmore.
Par ailleurs, l'univers Marvel ne lui est pas complètement inconnu puisqu’elle a mis en scène deux épisodes de Marvel's Jessica Jones en 2015.