Le réalisateur Hiroyasu Ishida et le character-designer Yojiro Arai se connaissent depuis de nombreuses années : ils se sont liés d’amitié après avoir découvert leurs illustrations sur un site de partage en ligne spécialisé. Ensemble, ils ont fondé le studio Colorido, qui produit Le Mystère des pingouins. Ishida, qui considère que le dessin animé a plus de puissance que le seul dessin sur papier grâce à sa dimension sonore et musicale, est un grand admirateur d'Ernest & Célestine. Son comparse apprécie aussi bien le manga que la BD franco-belge et des auteurs comme Enki Bilal ou Moebius.
Hiroyasu Ishida se distingue à seulement 21 ans quand il signe le court métrage Fumiko no Kokuhaku qui remporte le YouTube Video Award. Le réalisateur Mamoru Hosoda ne tarit pas d'éloges à son sujet : "Je le trouve extrêmement doué, il peut travailler à n’importe quel poste".
Le Mystère des Pingouins est tiré du roman Penguin Highway de Tomihiko Morimi, lauréat du Grand Prix Nihon SF 2010 au Japon. Ses précédentes oeuvres (Night is Short, Walk on Girl, The Tatami Galaxy) ont également été adaptées en animation par Masaaki Yuasa. Si le livre est destiné à un public adolescent et jeune adulte, le film se veut plus grand public.
Colorido est un jeune studio plutôt spécialisé à ses débuts dans les formats courts tels que les courts métrages ou les spots publicitaires. Composé à l'origine de 40 personnes, le studio a dû revoir ses effectifs à la hausse pour mettre au point Le Mystère des pingouins : 200 personnes en externe ont été engagées pour travailler pendant trois ans sur le film.
Hiroyasu Ishida avait réussi à passer la première partie de l'examen à l'entrée du studio Ghibli mais n'est pas allé plus loin : "[...] je ne me suis juste pas présenté. Je pense que ce n’était vraiment pas la bonne manière de refuser… ! Mais à cette époque, si j’avais été engagé, il aurait fallu que j’arrête l’université. Et je voulais finir mon année. Je voulais juste être un étudiant comme les autres et j’étais également obsédé par l’idée de finir mon film de fin d’étude !"