Axelle Ropert a eu l'idée de se lancer dans ce projet suite à une scène à laquelle elle assistait tous les matins devant une école de son quartier. La réalisatrice y observait une mère aveugle qui accompagnait sa fille. Elle se rappelle :
"C’était un spectacle que j’aimais bien car il était « double ». Émouvant car, évidemment, cela fait mal au coeur de voir une jeune femme aveugle avec une petite fille ; mais comique aussi car cette mère n’avait aucun scrupule, arrivait tambour battant avec sa canne qu’elle cognait à droite et à gauche, les autres parents obligés de faire de petits sauts pour l’éviter... Elle faisait irruption de manière très ostentatoire, et j’aimais bien ce mélange de gêne et d’émotion qu’elle provoquait."
Avant de s'atteler à la mise en scène de La Prunelle de mes yeux, Axelle Ropert a revu Tootsie et Victor Victoria pour la thématique d'un personnage se faisant passer pour un/une autre. La cinéaste développe : "J’ai observé qu’il y avait tout de même une mise en place extrêmement longue pour faire passer la pilule : à chaque fois, ce sont des raisons économiques qui forcent les personnages à l’imposture. Dustin Hoffman et Julie Andrews, respectivement, ne trouvent pas de travail pour leur sexe, et sont obligés chacun de se travestir pour déjouer une pression sociale et économique très construite en amont par le film."
La Prunelle de mes yeux est une comédie romantique pour Axelle Ropert. En écrivant le film, la réalisatrice s'est donnée un pari, celui de réinjecter la profondeur et la gravité de l’amour dans la romcom. "À partir du moment où l’amour affleure, la tragédie s’invite aussi dans le récit. Faire que l’amour ait du poids et de l’importance, que ce ne soit pas une petite convention supplémentaire ajoutée au cahier des charges du genre ; faire que ce soit vraiment déchirant. Cela a un côté casse-gueule, car si c’est déchirant, soudain ce n’est plus si drôle, c’était un équilibre périlleux à mettre en place !", confie-t-elle.
Après de nombreuses auditions d'actrices de 20-30 ans, c'est finalement Mélanie Bernier (Les Gamins, Un peu, beaucoup, aveuglément) qui a été choisie. La raison ? "Sa capacité à jouer à la fois le drame et la comédie et également parce qu'elle n'a pas peur du ridicule, ce qui n’est pas si fréquent chez les actrices ravissantes", d'après Axelle Ropert.
Pour le personnage de Théo, Axelle Ropert recherchait un garçon séduisant, nonchalant et grossier mais aussi capable de lyrisme. Son modèle était un mélange de Jacques Dutronc jeune et d’Hippolyte Girardot de l'époque Un monde sans pitié.
A un certain stade du scénario, le personnage de Bastien Bouillon était dessinateur à Charlie Hebdo. Axelle Ropert a même rencontré Luz pour lui poser des questions sur son métier. Finalement, la réalisatrice a laissé tomber cette idée.
Glenn Gordon Caron est crédité au générique dans les remerciements. Il s'agit du showrunner de la série Clair de lune avec Bruce Willis dont il a écrit la première saison à l’âge de trente ans dans les années 1980. Axelle Ropert développe le lien entre elle et cette personne :
"J’ai traversé un moment délicat pendant l’écriture du scénario qui concernait la question du réalisme : est-ce qu’on est dans un réalisme lambda qui interdit beaucoup de fantaisie, ou au contraire dans quelque chose de magique où tout peut arriver ? Aucune des deux solutions ne me convenait, et je n’arrivais pas à trouver un modèle dans le cinéma français qui puisse m’aider. À la faveur d’un article qu’on m’a commandé, je me suis replongée dans cette série éblouissante avec Bruce Willis et Cybill Shepherd, et là, ça m’a libérée pour l’écriture. J’y ai trouvé l’équation idéale entre le réalisme, et des envolées incessantes de pure fantaisie ; entre le travail quotidien, les enquêtes à mener et des moments d’inventivité absolument foufous."