Né en 1966 à LaSalle au Québec, Stéphane Rousseau fréquente les scènes de cabarets dès l'âge de treize ans. En 1987, il entame une carrière à la radio et obtient des records d'écoute pour son émission en tant qu'animateur vedette de CKMF, quatre ans plus tard. C'est également l'année de son premier essai au festival « Juste pour rire » de Montréal. Très populaire au Canada, il est repéré par Pascal Légitimus, qui décide de le produire en France. Sa première apparition sur grand écran a lieu dans Les Dangereux de Louis Saia.

En 2002, Stéphane Rousseau impose la force et la justesse de son jeu dans Les Invasions barbares de Denys Arcand. Acquérant une certaine notoriété en France, il poursuit sa carrière au cinéma en intégrant le prestigieux casting d'Astérix aux Jeux Olympiques puis en donnant la réplique à Alexandra Lamy dans Modern Love en 2007.

Toujours aussi célèbre au Canada, Stéphane Rousseau collabore très souvent avec l'humoriste français Franck Dubosc, sur scène ou à la télévision. En 2010, c'est le très comique Michaël Youn qui le choisit pour jouer à ses côtés dans sa première comédie, Fatal.