Acteur dès son plus jeune âge, Josh Hartnett se produit sur les planches de son école, à Minneapolis. Après une formation de comédien à la State University of New York, il s'installe à Los Angeles et apparaît dans des spots publicitaires, puis dans la série télévisée Cracker. Ses débuts sur grand écran, il les vit en 1998 dans le film d'horreur Halloween, 20 ans après. Catalogué au rayon fantastique avec sa participation dans The Faculty (1999) de Robert Rodriguez - ce dernier fera de nouveau appel à lui en 2004 pour l'adaptation du comic book Sin City -, Josh change de registre pour interpréter le drame intimiste The Virgin suicides de Sofia Coppola.
C'est en endossant l'uniforme de l'armée américaine dans les grosses productions Pearl Harbor (2001) et La Chute du faucon noir (2002) qu'il accède à la consécration. Devenu acteur de tout premier rang, il aime incarner les jeunes premiers séducteurs dans O (2002), l'adaptation de la pièce de William Shakespeare Othello, la comédie romantique 40 jours et 40 nuits (2003) et Rencontre à Wicker Park (2004), le remake américain du film français L'Appartement. Il va jusqu'à donner la réplique aux plus grands comme Harrison Ford, dont il est le coéquipier dans la comédie policière Hollywood homicide (2003), et le trio formé par Bruce Willis, Morgan Freeman et Ben Kingsley dans le film de gangsters Slevin (2006).
Les plus grands réalisateurs commencent à s'intéresser à lui. Ainsi en 2006, il joue aux côtés de Scarlett Johansson dans Le Dahlia noir de Brian De Palma puis est dirigé par le réalisateur de Hard Candy dans le film de vampires 30 days of night. Il interprète ensuite un autiste dans Mozart and the Whale puis donne la réplique à Samuel L. Jackson dans Renaissance d'un champion. Malheureusement, l'acteur tend à devenir une valeur peu fiable au box-office. En témoignent les méconnus August (2008) et Bunraku (2011).
Comme beaucoup, Josh Hartnett se dirige en 2013 vers le petit écran en campant, durant trois saisons, l'un des personnages principaux de la série horrifique Penny Dreadful, celui d'un homme aguerri au combat qui fait équipe avec Eva Green et Timothy Dalton dans leur traque incessante des forces du mal...
L'acteur ne délaisse pas pour autant le cinéma et est régulièrement sollicité, notamment par Roland Joffé (La Prophétie de l'anneau) et Robert Duvall (Wild Horses), mais la majorité de ses films passent inaperçus, certains demeurant même inédits en France (Valley Of The Gods avec John Malkovich, She's Missing avec Eiza Gonzalez). Seule la co-production nippo-américaine Oh Lucy ! en 2018 tire son épingle du jeu en étant sélectionnée à la Semaine de la critique du Festival de Cannes 2017. Le comédien y incarne un professeur d'anglais dont s'amourache l'héroïne, une Japonaise esseulée qui traverse l’océan Pacifique pour le retrouver.
Josh apparaît ensuite dans les thrillers méconnus She's Missing, Inherit the Viper et Suspect numéro un, puis est sollicité à deux reprises par Guy Ritchie. Dans Un homme en colère, remake du Convoyeur de Nicolas Boukhrief, et dans Operation Fortune : Ruse de guerre, où l'acteur fait montre de ses talents comiques en jouant une star de cinéma adulée par le marchand d'armes milliardaire Hugh Grant. En 2023, il campe le physicien Ernest Lawrence dans le primé Oppenheimer, avant de retourner au thriller avec Trap de M. Night Shyamalan, où il incarne un tueur en série qui se retrouve piégé lorsqu'il se rend à un concert avec sa fille.
N'oubliant pas le petit écran, le natif de Saint Paul prend parallèlement part aux séries Paradise Lost, Die Hart, Exterminez toutes ces brutes, The Fear Index et Black Mirror.