John Cho nait en 1972 à Séoul, mais sa famille quitte la Corée du Sud pour aller s’installer à Los Angeles alors qu’il n’est qu’un enfant. Aux États-Unis, il poursuit de brillantes études et, après avoir obtenu un diplôme de littérature anglaise à l’Université de Berkeley, il enseigne un temps l’anglais dans un collège. En parallèle, il commence la comédie en rejoignant la troupe théâtrale composée exclusivement d’américains originaires d’Asie "East West Players".

En 1997, John Cho apparaît pour la première fois sur les écrans de cinéma en obtenant des petits rôles dans Shopping For Fangs et Des hommes d'influence. Il participe, la même année, à un épisode de la série télévisée Boston Common. Au début de sa carrière, l’acteur va ainsi alterner les rôles de guest-star dans des séries (on peut le voir dans Charmed, Felicity, Les Sept mercenaires...), et des petits rôles au cinéma, notamment dans Bowfinger, roi d'Hollywood (1999), American Beauty (id.) ou Les Pieds sur terre (2001).

Cependant, en 1999, John Cho fait une apparition rapide mais remarquée dans le premier volet de la saga American Pie. Son personnage reste dans les mémoires en utilisant le terme "MILF" (à propos des mères que les adolescents trouvent attirantes), qui est depuis rentré dans la culture populaire. Il reprend ainsi son rôle dans les trois autres volets de la franchise. Dans le même temps, il continue à apparaitre dans différents films tels que le délirant Evolution (2001), le mystérieux Solaris (2003) et surtout Better Luck Tomorrow (2002), un drame sur les conditions de vie des lycéens américains d'origine asiatique.

De 2001 à 2002, John Cho est un personnage régulier de la sitcom Sexe et dépendances, mais c’est en 2004 que le comédien se fait réellement connaitre en incarnant Harold dans la comédie Harold & Kumar Chassent Le Burger. En 2008, il retrouve son complice Kal Penn (Kumar) pour Harold et Kumar s'évadent de Guantanamo. Entre les deux, il participe à la très courte série Kitchen Confidential (2005-2006) et apparaît dans des épisodes de Dr House, Grey's Anatomy, How I Met Your Mother et Ugly Betty. Au cinéma, il partage deux fois de suite l'affiche avec Dennis Quaid dans les comédies de Paul Weitz, En bonne compagnie (2005) et American Dreamz (2006).

2009 est une année importante dans la carrière de John Cho, qui incarne Hikaru Sulu (précédemment joué par George Takei) dans le reboot de Star Trek réalisé par J.J. Abrams, ainsi que dans ses suites, Star Trek Into Darkness (2013) et Star Trek: Sans limites (2016). En 2009, il est également l'un des personnages principaux de la série événement d’ABC, FlashForward, qui ne rencontre malheureusement pas le succès escompté. L’acteur profite de l’annulation de la série pour retourner au cinéma. Ainsi, en 2011, il reprend son personnage dans Le Joyeux Noël d'Harold et Kumar. L'année suivante, il est à l’affiche de Total Recall Mémoires Programmées, remake du film culte de Paul Verhoeven (1990).

Très présent la télévision, John Cho obtient des rôles importants dans les séries télévisées comiques Go On et Selfie. Le comédien goûte également aux joies du fantastique comme ses prestations dans Sleepy Hollow et L'Exorciste en témoignent. Côté grand écran, il participe la plupart du temps à des films inconnus en France, comme Zipper, Grandma, Get a Job, Columbus, Le Mariage de Mon Ex ou encore Caller ID: Entity.

2018 marque une date importante dans sa carrière puisqu'il joue le personnage principal du thriller high-tech Searching: Portée disparue, celui d'un père prêt à tout pour retrouver Margot, sa fille de 16 ans qui a disparu. Bénéficiant d'une sortie dans les salles françaises, le long métrage de Aneesh Chaganty a comme particularité de se dérouler intégralement sur des écrans d’ordinateur, de téléphone, de go-pro, etc. Cho revient sur le tournage de ce film atypique : "Ça n’a pas été facile, loin s’en faut, car l’objectif de la caméra était sans arrêt sur moi, ce qui interdit toute fausse note. Le film est donc très fidèle à la réalité. Chaque scène est tournée depuis un angle unique et l’histoire est entièrement racontée du point de vue de David ; il n’y avait par conséquent aucune échappatoire, je devais être concentré et présent à chaque instant car il n’y avait rien ni personne pour rattraper mes erreurs. Ça a été une expérience très exigeante et intense sur le plan émotionnel".