Dès son plus jeune âge, la Madrilène Pilar López de Ayala fait du théâtre amateur, avant de prendre des cours d'interprétation. Ses premières prestation en dehors des scènes théâtrales ont lieu à la télévision, où elle participe à de nombreuses séries comme Yo, Una Mujer, Contigo Pan y Cebolla ou encore Menudo Es Mi Padre.
La première expérience cinématographique de María del Pilar López de Ayala Arroyo, ou simplement Pilar López de Ayala, est un rôle secondaire dans le film pour enfants El niño invisible (1995), de Rafael Monleón. Elle poursuit en même temps les rôles à la télévision, notamment dans la série Al Salir de Clase diffusée entre 1997 et 2011, un grand succès parmi les adolescents espagnols. Elle s'essaie encore au cinéma, toujours dans des rôles secondaires, dans Quand tu me reviendras (1999) de Gracia Querejeta et Une Vie de rêve (2000) d'Antonio Cuadri, aux côtés de Salma Hayek.
Son premier rôle principal ne tarde pas à arriver : en 2000, elle est invitée à jouer María, une jeune femme qui abandonne tout par amour dans le drame social Bailame el agua, de Josecho San Mateo. Elle intègre cette même année le casting de Kisses for Everyone, comédie populaire dans laquelle l'actrice donne la réplique à Emma Suárez et Luis Tosar (Cellule 211). Son rôle de jeune fille bourgeoise lui vaut une mention au Goya du meilleur espoir - qui se confirme très vite, d'ailleurs, puisque l'année suivante elle incarne Jeanne de Castille, "la folle", dans Juana la loca (2001), pour lequel elle reçoit le Goya récompensant la meilleure actrice.
Après ce grand succès populaire, la comédienne alterne avec aisance les petites productions locales et les films espagnols à très gros budget. Elle alterne les participations dans les drames espagnols Obaba (2005), Bienvenido a casa (2006) et Dans la ville de Sylvia (2007), avec le biopic d'aventure Capitaine Alatriste (2006), dans lequel elle partage la scène avec Viggo Mortensen et Elena Anaya.
La comédienne s'essaie ensuite à des coproductions internationales, dans les rôles les plus divers. Le drame français Comme les autres (2008) lui offre un personnage de mère porteuse pour un couple homosexuel ; le film policier hispano-mexicain Venganza (2008) la plonge dans l'univers d'un groupe de femmes vengeresses ; tandis qu'elle incarne un fantôme qui hante Ricardo Trepa dans le film portugais (2010), du réalisateur Manoel de Oliveira. Depuis qu'elle entame ce tour des pays et des langues, Pilar López de Ayala devient l'une des actrices espagnoles les plus prisées des jeunes réalisateurs internationaux. En 2010, le cinéaste brésilien Andrucha Waddington la choisit pour le rôle féminin principal de Lope, une fresque d'époque sur le dramaturge Lope de Vega. En 2011, elle se lance en outre-Atlantique pour tenir le rôle central dans Medianeras, chronique sur la vie solitaire à Buenos Aires. S'aventurant dans tous les genres, elle expérimente la science-fiction dans l'hispano-philippin Buenas noches, España (2011), de Raya Martin, et l'horreur dans la production hispano-américaine Intruders (2011), avec Clive Owen et Daniel Brühl.