Powers Boothe décroche son premier rôle au cinéma dans The Goodbye girl (1977), une comédie romantique de Herbert Ross avec Richard Dreyfuss. Il fait également une apparition en vendeur de foulards dans Cruising (1980) de William Friedkin, avant d'être consacré par la télévision. Powers Boothe remporte en effet en 1981 un Emmy Award en tant que meilleur comédien pour son interprétation du révérend Jim Jones dans le téléfilm Guyana tragedy : the story of Jim Jones.

Dès lors, cet acteur charismatique et au regard noir se voit proposer des rôles plus intéressants au cinéma. Il aime à incarner des personnages de militaires endurcis dans Sans retour (1981) de Walter Hill, L' Aube rouge (1984) de John Milius, ou encore Les Chemins de la dignité (2001) de George Tillman Jr..

En 1985, Powers Boothe figure en haut de l'affiche de La Forêt d'émeraude de John Boorman, partant à la recherche de son fils disparu. Habitué aux thrillers ainsi qu'aux films d'action, il interprète également à merveille les rôles de criminels, que ce soit dans Extrême préjudice de Walter Hill, Tombstone de George Pan Cosmatos ou encore Mort subite, qui le voit affronter Jean-Claude Van Damme.

Certains réalisateurs l'imaginent, pour leur part, en représentant des forces de l'ordre. C'est le cas de Dwight H. Little qui lui demande de prêter main forte à Brandon Lee dans Rapid fire en 1992, d'Oliver Stone, sous la direction duquel il tourne Nixon et U-Turn, et de Bill Paxton qui l'engage sur le tournage de Emprise en 2001. Dans Sin City (2005) et sa suite, il se distingue auprès de la nouvelle génération en incarnant le terrible sénateur Roark aux côtés de Bruce Willis et Jessica Alba.

Après avoir incarné le général romain Flavius Aeius, mentor d'Attila, dans la mini-série Attila le Hun, Powers Boothe trouve un rôle récurrent dans la série western Deadwood puis poursuit un joli succès tardif sur petit écran avec des rôles dans Nashville et la série Marvel Les Agents du SHIELD. Un univers Marvel qu'il découvre également au cinéma avec un petit rôle dans Avengers.