Fille des acteurs Alain Doutey et Arielle Séménoff.

Ayant grandi dans une famille de comédiens, Mélanie Doutey s'inscrit au Cours Périmony pour ensuite faire ses débuts devant la caméra en 2000 avec la comédie dramatique Les Gens qui s'aiment de Jean-Charles Tacchella. Elle poursuit ses études au Conservatoire National d'Art Dramatique de Paris et se retrouve à partager l'affiche du Frère du guerrier (2002) avec Guillaume Canet et Vincent Lindon. Gravissant un à un les échelons du vedettariat, elle joue l'année suivante le rôle-titre de Leïla de Gabriel Axel.

Troublé par le charmant minois de la demoiselle, Claude Chabrol lui confie le rôle de l'ingénue Michèle dans la très remarquée Fleur du mal (2003). Compagne de l'acteur Gilles Lellouche qu'elle aura pour partenaire dans Narco (2004), On va s'aimer (2006), Ma place au soleil (2007) et Une petite zone de turbulences (2010), elle se rend véritablement populaire en incarnant à la télévision Clara Sheller, une trentenaire à la recherche de l'homme idéal.

Après un passage par l'Espagne pour le tournage du thriller de Miguel Courtois, El Lobo, Mélanie Doutey fait une incursion dans le film d'époque avec Il ne faut jurer de rien !, inspiré de l’œuvre d'Alfred de Musset. Sa prestation de la noble Cécile lui vaut d'être nommée en 2006 au César du Meilleur espoir féminin, sa deuxième citation dans cette catégorie après celle obtenue en 2003 pour Le Frère du guerrier.

A l'affiche des thrillers Fair Play (2006) et Président (id.), Mélanie Doutey renoue avec la comédie légère en s'illustrant dans Ce soir, je dors chez toi (2007) aux côtés de Jean-Paul Rouve et Kad Merad, partenaire qu'elle retrouve sur le tournage de RTT en 2009. La même année, elle figure au sein du prestigieux casting féminin du Bal des actrices de Maïwenn et goûte à la vie en entreprise pour Rien de personnel, premier long métrage de Mathias Gokalp, avant de passer par Une petite zone de turbulences aux cotés de son compagnon Gilles Lellouche, ainsi que Michel Blanc.

Après s'être essayée au doublage de film d'animation pour la version française de Cars 2 en 2011, la comédienne retrouve les plateaux de tournage la même année pour un thriller relevé à la sauce informatique et dirigé par Cédric Jimenez, lequel lui permet de se retrouver Aux yeux de tous.