Justin Theroux nait à Washington D.C. d’une mère journaliste pour le Washington Post et d’un père avocat. A l’université, il étudie l'art puis déménage à New York dans l’espoir de faire carrière dans les arts visuels. Finalement, c’est sur scène qu’il va s’épanouir dans différentes pièces Off Broadway.
En 1995, il fait sa première apparition à la télévision dans un épisode de la série Central Park West, puis enchaîne les seconds rôles dans des films mineurs (Romy et Michelle 10 ans après, Frogs for snakes) et des séries populaires (Ally McBeal, Sex & the City). Son premier rôle important au cinéma est celui de Timothy Bryce dans l’adaptation du roman de Bret Easton Ellis : American Psycho (2000), réalisé par Mary Harron, qui l’avait déjà dirigé dans le biopic I Shot Andy Warhol (1996), le tout premier long métrage du comédien.
En 2001, Justin Theroux tourne pour la première fois devant la caméra de David Lynch pour Mulholland Drive, prix de la mise en scène au festival de Cannes. A partir de cette première collaboration (il retrouvera le réalisateur en 2007 pour l'envoûtant Inland Empire), le visage du comédien devient plus familier du public, mais sa carrière ne décolle jamais réellement, et ce malgré son talent et sa présence dans de nombreuses productions connues. Eternel second couteau, il participe, à la télévision, aux deux premières saisons de Washington Police (2000-2001), et obtient un rôle récurrent dans la série culte Six Feet Under (2003-2004).
Très éclectique (méchant dans Charlie's Angels - les anges se déchaînent, détective dans Miami vice - Deux flics à Miami de Michael Mann, doubleur dans Megamind, etc.), Justin Theroux s'affiche dans les comédies Zoolander (2002) et 1 duplex pour 3 (2004), à chaque fois en compagnie de Ben Stiller, avec lequel il écrit, quatre ans plus tard, le déjanté Tonnerre sous les Tropiques (2008), au sein duquel s'illustre un certain Robert Downey Jr.. Ce dernier, ayant beaucoup apprécié l’expérience, recommande alors Justin Theroux pour écrire le scénario du très lucratif film super héroïque Iron Man 2 (2010).
En 2006, le comédien réalise son premier film, Dedication, une comédie dramatique projetée au Festival de Sundance mais toujours inédite en France. Tout comme la comédie The Ten (tournée en 2007 et où il joue Jésus Christ !) de David Wain, réalisateur qu’il retrouve en 2012 pour Peace, Love et plus si affinités, film dans lequel il a pour partenaire Paul Rudd et Jennifer Aniston, qui devient sa petite amie à la ville. Il reprend, ensuite, la plume pour écrire le très rock 'n' roll Rock Forever. Justin devient ensuite Kevin Garvey, le héros de la série The Leftovers, créée par Damon Lindelof. En parallèle, le comédien continue de tourner pour le cinéma en reprenant son rôle de Evil DJ dans Zoolander 2, qu'il a également co-écrit avec ses acolytes Ben Stiller, Nicholas Stoller et John Hamburg. En 2016, il donne la réplique à Emily Blunt dans La Fille du train, adaptation du best-seller écrit par Paula Hawkins.