Lana Parrilla grandit à Brooklyn et développe très jeune un goût pour la comédie, inspirée par sa tante, l'actrice Candice Azzara. Elle suit des cours à Los Angeles et démarre sa carrière par deux apparitions dans la série "Grown Ups". Elle obtient ensuite le rôle régulier d'Angie Ordonez dans la 5ème saison de Spin City (2000), puis dans Boomtown (2002). Après un passage par New York Police Blues et Six Feet Under (2004), elle est recrutée à la Cellule Anti-Terroriste de 24 heures chrono (2005).