Dès 12 ans, Grégoire Colin se produit sur scène dans les pièces Hécube d'Euripide et Brûle, rivière, brûle. Il décroche ses premiers rôles à la télévision dans le téléfilm Le Jeu du roi en 1988 et au cinéma dans Le Silence d'ailleurs. Mais c'est L' Année de l'éveil de Gérard Corbiau qui le révèle au grand public ; il y incarne François, un enfant de troupe orphelin, initié durement à la vie d'adulte dans une école militaire.

Jeune moine orthodoxe dans Before the rain, Lion d'or à la Mostra de Venise 1991, Grégoire entame avec Claire Denis une fructueuse collaboration qui débutera par le téléfilm US Go Home (1994) diffusé sur Arte et se poursuivra avec les drames Nénette et Boni (1996), film pour lequel il reçoit le grand prix d'interprétation masculine au Festival de Locarno, Beau travail (1999), Vendredi soir (2002) et L'Intrus (2005).

Dès lors, Grégoire Colin, que l'on a longtemps comparé à Benoît Magimel, son partenaire dans la série Jalna (1994), impose son regard noir et son physique de jeune premier tourmenté dans bon nombre de films d'auteur, parmi lesquels Fiesta (1995) de Pierre Boutron, Secret défense (1998) de Jacques Rivette, La Vie rêvée des anges (id.) d'Erick Zonca ou encore Sex is comedy (2002) de Catherine Breillat.

Peu convaincu par sa prestation dans le film d'action Snowboarder (2003), Grégoire Colin se tourne définitivement vers le cinéma d'auteur, participant à La Guerre à Paris de Yolande Zauberman, plongeant dans l'univers surréaliste de Raoul Ruiz (Le Domaine perdu, 2004), jouant les Voleurs de chevaux aux côtés d'Adrien Jolivet et incarnant des personnages des plus inquiétants dans Exes (2005) et Le Tueur (2007).

Il poursuit avec 35 rhums de sa cinéaste fétiche Claire Denis, qu'il retrouve dans Les Salauds (2013). Il collabore aussi trois fois avec Alice Winocour, pour Augustine (2012), Proxima (2019) et Revoir Paris (2022).

Menant une carrière discrète et privilégiant le cinéma d'auteur, Grégoire Colin incarne Jean Cocteau Opium d'Arielle Dombasle, puis apparaît, par le biais de rôles secondaires, dans Le Prix du succès, Barbara, L'État sauvage, Camille, Si le vent tombe, Passion simple et Mon légionnaire. Côté séries, on peut le voir dans Zone blanche, Capitaine Marleau, Lupin ou encore Disparu à jamais.

En 2022, Grégoire Colin tourne à nouveau pour Claire Denis dans Avec amour et acharnement et se retrouve, pour l'occasion, pris dans un triangle amoureux en compagnie de Vincent Lindon et Juliette Binoche. Cette même année, il est à l'affiche de Revoir Paris, un drame sur la mémoire post-traumatique liée aux attentats signé Alice Winocour, avec Virginie Efira et Benoît Magimel.