Fille d'un chirurgien et d'une antiquaire, Julie Gayet se passionne très tôt pour le monde du spectacle. A 8 ans, elle se lance dans le chant lyrique, avant de s'orienter vers la comédie à 14 ans. Elle part à Londres à 17 ans pour suivre les cours de Jack Waltzer, membre de l'Actor's Studio. Egalement passée par l'Ecole du Cirque, elle étudie par ailleurs l'Histoire de l'art et les Sciences Humaines à l'Université.

Figurante dans Bleu de Kieslowski en 1993, Julie Gayet trouve la même année son premier vrai rôle, celui d'une séduisante funambule, dans A la belle étoile. Agnès Varda la choisit ensuite pour incarner l'étudiante qui part à la rencontre de Monsieur Cinéma, alias Michel Piccoli, dans Les Cent et une nuits, hommage malicieux au 7e Art centenaire. En 1996, elle est l'héroïne de deux films qui permettent de dévoiler différentes facettes de son talent : la comédie à succès Delphine 1 - Yvan 0 de Dominique Farrugia et Select Hotel de Laurent Bouhnik, dans lequel elle incarne une prostituée junkie, composition qui lui vaut le Prix Romy Schneider.

Louée pour son naturel, Julie Gayet se plaît à changer d'allure et de registre de film en film : lesbienne dans Pourquoi pas moi?, aveugle dans Ma caméra et moi, elle campe une coiffeuse amoureuse de l'indécis Pascal Greggory dans La Confusion des genres en 2000. Cette actrice qui sait allier espièglerie et sensibilité, participe volontiers à des premiers (Clara et moi) ou deuxièmes (La Turbulence des fluides) films, ce qui ne l'empêche pas de tourner avec Michel Deville (Un monde presque paisible en 2002), Jean-Pierre Limosin (Novo) ou Patrice Leconte (Mon meilleur ami).

En 2004, elle part en Ecosse (la love story gothique A woman in winter) puis en Algérie (Bab el web de Merzak Allouache) avant de participer en 2007 à une comédie très française, Un baiser s'il vous plaît d'Emmanuel Mouret.

Sa carrière continue de plus belle puisqu'elle est invitée à prêter sa voix à l'un des personnages du film d'animation Kérity la maison des contes en 2009, avant de camper une belle-soeur un peu coincée dans la comédie Pièce montée. En 2010, elle découvre la casquette de productrice, d'abord pour le film Huit fois debout, dans lequel elle est aussi l'actrice principale, puis pour le film Les Secrets de Raja Amari.

Si Julie Gayet privilégie la comédie (L'Art de séduire, Nos plus belles vacances, Love Addict, Le Gendre de ma vie...), elle joue aussi dans le thriller Sans laisser de traces, la politique-fiction Quai d'Orsay, l'original film romantique nocturne After, le drame carcéral La Taularde et le film d'aventures Poly. Parallèlement, elle incarne Sophie, fille de la déjantée Chantal Ladesou, dans la trilogie de Gabriel Julien-Laferrière C'est quoi cette famille ?!, C'est quoi cette mamie ?! et C'est quoi ce papy ?!.

Côté petite lucarne, Julie Gayet campe l'héroïne de la série France 3 Soupçons en 2019, dans laquelle une romance extra-conjugale se mêle à une enquête centrée sur une disparition inquiétante.