Tout petit, Dylan O’Brien baigne déjà dans le milieu du cinéma de par les métiers de ses parents (un père, caméraman et une mère, ancienne actrice). Né à New York, il grandit dans le New Jersey, jusqu'à l'âge de douze ans. Par ailleurs, il est ce que l’on peut nommer un “Tutti Frutti”, il a en effet plusieurs origines : irlandaises, anglaises, italiennes et espagnoles. 

En 2005, il décide d'agrémenter son compte YouTube en y postant des vidéos dans lesquelles il se met en scène avec ses amis. Grâce à cela, il se fait remarquer par une productrice et réalisatrice qui lui propose de collaborer avec elle sur une web-série. Entre temps, il finit brillamment le lycée et décide de partir étudier à l’Université de Syracuse. Il se rétracte cependant et emménage à Los Angeles pour tenter une carrière de comédien. Dylan O'Brien y fait la connaissance d’un acteur qui lui présente un agent artistique. 

Son agent le pousse à passer des castings pour la série fantastique Teen Wolf en 2010. Après avoir passé quatre auditions, il obtient enfin le rôle de Stiles Stilinski, le meilleur ami du personnage principal Scott McCall interprété par Tyler Posey. La série dure jusqu'en 2017. Parallèlement, le natif de New York se fait engager pour se glisser dans la peau du héros du Labyrinthe, aux côtés d’autres jeunes comédiens comme Kaya Scodelario, Thomas Brodie-Sangster, Aml Ameen, Ki Hong Lee ou encore Will Poulter.

Le long métrage donne lieu à deux suites : La Terre brûlée (2015) et Le Remède mortel (2018). Restant dans le domaine grand public, Dylan O’Brien rejoint Mark Wahlberg dans le film catastrophe Deepwater, puis combat le terrorisme dans American Assassin. En 2018, il double l'irrésistible voiture Bumblebee. Deux ans plus tard, il tente de survivre dans un monde post-apocalyptique envahi par des monstres dans Love and Monsters. L'année suivante, il retrouve Wahlberg pour le thriller SF Infinite.