Elevé à Leeds, Peter O'Toole entame une carrière de journaliste avant de se lancer dans le théâtre au début des années 50. Il étudie à la Royal Academy of Dramatic Arts où ses camarades de classe sont Alan Bates et Richard Harris. Puis il devient membre de l'Old Vic de Bristol.
Il fait ses premières apparitions au cinéma en 1960 dans L' Enlèvement de David Balfour de Robert Stevenson et Les Dents du diable de Nicholas Ray. Mais c'est avec Lawrence d'Arabie (1962, David Lean) qu'il connaît la consécration. Il y incarne le célèbre aventurier-écrivain et trouve là un rôle des plus charismatiques. Il est par la suite tout désigné pour tenir des rôles historiques et de stature imposante. Il est le roi Henri II d'Angleterre dans Becket de Peter Glenville (1962), aux côtés de Richard Burton et John Gielgud avec lesquels il forme un trio so british de premier ordre. De formation théâtrale, il appartient à cette génération d'acteurs anglais partagés entre les planches et le grand écran.
Après de grands rôles dramatiques, il enchaîne avec des comédies à succès telles que Quoi de neuf Pussycat ? (1965) ou encore Comment voler un million de dollars (1966). Dans ces comédies, il côtoie les plus grandes stars de son époque. C'est l'époque du glamour et du burlesque. Il n'en oublie pas pour autant des personnages plus denses comme dans La Bible de John Huston (1965). Il est nommé à sept reprises aux Oscar mais n'a pas encore reçu la prestigieuse récompense.
Il navigue entre théâtre, cinéma et télévision où il incarne tour à tour des personnages dramatiques ou plus légers, parfois ambigus. Il se fait plus rare au cinéma dans les années 70. Dans les années 80 et 90, il revient dans des films tels que Supergirl (1984), Club Paradise (1986, Harold Ramis), Le Dernier Empereur (1987, Bernardo Bertolucci), Ralph Super King (1991) et Phantoms (1998). Il apparaît donc tour à tour dans un film de super-héros, deux comédies, un drame historique et un film d'horreur. Il confirme ainsi sa tendance à osciller d'un genre à l'autre, entre pur divertissement et films historiques. Il se consacre ensuite davantage à la télévision mais renoue avec le 7ème Art en 2003 puisqu'il figure au générique de Bright young things avant d'incarner l'année suivante le roi Priam dans Troie de Wolfgang Petersen. Il se distingue enfin en 2007 en prêtant sa voix à l'inquiétant critique culinaire Anton Ego dans Ratatouille des Studios Pixar.