Diplômé de la Westdale High School de Hamilton, Eugene Levy doit ses premières apparitions à l'écran au réalisateur Ivan Reitman qui le dirige dans deux petites productions canadiennes : Foxy Lady (1971) et Cannibal girls (1973). Mais c'est la série comique "SCTV", dont il est l'interprète et le coauteur pendant huit saisons, qui lui permet de se faire connaître du public américain et de remporter deux Emmy Awards en tant que co-scénariste. Ce programme télévisé marque également sa rencontre avec Harold Ramis pour qui il jouera dans Bonjour les vacances (1983), Club Paradise (1986) et Mes doubles, ma femme et moi (1996), et John Candy à qui il donnera la réplique dans Armed and dangerous (1986), Speed zone ! (1989) et qu'il dirigera dans son premier long métrage en tant que réalisateur, Banco pour un crime (1992).

Fidèle, Eugene Levy l'est aussi à l'égard du cinéaste Christopher Guest avec qui il collabore sur trois comédies : Waiting for Guffman (1996), Almost heroes (1998) et Bêtes de scène (2000). Mais la consécration internationale arrive tardivement : ce n'est qu'à partir de 1999, avec son rôle de père de famille un peu trop embarrassant dans la trilogie à l'humour potache American pie, que ses airs d'ahuri renforcés par ses sourcils épais s'impriment dans l'esprit du grand public. Dans le même registre, il côtoie des transfuges de l'émission Saturday night live comme Tim Meadows dans Un homme à femmes (2000), Chris Rock dans Les Pieds sur terre (2001) ou encore Steve Martin dans Bronx à Bel Air (2003). Se contentant la plupart du temps de petits rôles, Eugene Levy accède, grâce à Les Mayfield, en tête d'affiche du buddy movie Le Boss (2005) aux côtés de Samuel L. Jackson.

Dans les années qui suivent, et pour des raisons purement financières, il reprend le rôle qui l'a rendu célèbre, dans les suites sorties DVD de la franchise American Pie avec No limit ! (2005), String Academy (2006), Campus en folie (2007) et Les Sex Commandements (2009). Pour autant, cela ne l'empêche pas de s'animer pour des projets plus excitants. Qu'il soit confronté de nouveau à Steve Martin (Treize à la douzaine 2), qu'il tourne avec Ang Lee (Hôtel Woodstock), ou qu'il donne de la voix (La Nuit au musée 2, Astro Boy), Eugene Levy cultive son envie de projets éclectiques, bien que restant exclusivement dans le registre familier de la comédie. Chassez le naturel, il revient au galop ! En 2012, Levy retourne finalement dans le quatrième opus d'American Pie, cette fois sur grand écran, et reste à ce jour le seul acteur à avoir participé à tous les épisodes de la saga !