Guillaume de Tonquédec commence sa formation au conservatoire de Versailles. Il assiste à des cours libres au cours Florent avant d’être retenu pour le Conservatoire national supérieur d’art dramatique de Paris.

En 1986, il obtient son premier rôle au cinéma dans le film réalisé par Pierre Granier-Deferre : Cours privé, puis la même année il joue dans On a volé Charlie Spencer ! de Francis Huster. Avec Tableau d’honneur de Charles Nemes en 1992, il décroche pour la première fois la tête d’affiche avec le personnage de Jules Martin. Parallèlement à sa carrière au cinéma où il enchaîne surtout les seconds rôles, il commence à tourner pour la télévision.

Grâce à la série Commissaire Cordier, dans laquelle il reviendra dans 10 épisodes avec le personnage de Thomas Sorensen, Guillaume de Tonquédec se glisse dans la peau d'un personnage récurrent. Sa carrière prend ensuite un tournant décisif lorsqu’il est engagé pour interpréter Renaud Lepic dans la série comique à succès : Fais pas ci, fais pas ça aux côtés de Bruno Salomone, Isabelle Gélinas et Valérie Bonneton. En 2010, il retrouve d’ailleurs Valérie Bonneton au cinéma (qui interprète sa femme, Fabienne Lepic dans la série), pour Qui a envie d’être aimé d’Anne Giafferi.

Vient la consécration en 2013, lorsqu’il reçoit le César du meilleur acteur dans un second rôle pour son personnage de Claude Gatignol dans la grinçante comédie Le Prénom, adaptée de la pièce éponyme et réalisée par Alexandre de La Patellière et Matthieu Delaporte. Actif sur scène, Guillaume de Tonquédec interprétait déjà ce personnage sur les planches.

Ses rôles prennent de plus en plus d'ampleur au cinéma, comme en témoignent ses participations remarquées à Divin enfant et Barbecue, deux comédies au casting impressionnant sortant toutes les deux au premier semestre de l'année 2014. Privilégiant les films comiques aux sujets dans l'air du temps, comme SMS, Bonne Pomme ou encore Coexister en témoignent, Guillaume de Tonquédec campe un petit producteur d’œufs bio dans Roxane, premier long métrage réalisé par Mélanie Auffret.