Suite à une formation en arts dramatiques au cours Périmony, Louis-Do de Lecquesaing se lance dans la mise en scène théâtrale, avec les représentations de La Campagne de Martin Crimp et Anéantis de Sarah Kane. En tant qu'acteur, il est dirigé par des metteurs en scène prestigieux comme Bruno Bayen, Valère Novarina et Andre Engel.

Il débute dans le cinéma dans le court-métrage de Cédric Kahn, Les Dernières heures du millénaire (1990). À peine un an plus tard, le comédien est choisi par Arnaud Desplechin pour le premier film du réalisateur, la chronique sur le deuil La Vie des morts, et ensuite par Claude Chabrol pour son adaptation de Madame Bovary, dans lequel il partage l'affiche avec Isabelle Huppert. Il renouvelle l'expérience avec Desplechin dans le troublant La Sentinelle (1992), avant de passer par les caméras de Jean-Luc Godard dans Hélas pour moi (1993) et de figurer sur le premier film de Pascal Bonitzer, Encore (1996).

Sans jamais quitter la scène, l'acteur poursuit sa carrière cinématographique, intégrant notamment des drames sentimentaux comme A vendre (1998) de Laetitia Masson et Les Destinées sentimentales (2000) d'Olivier Assayas. Il passe à la mise en scène de cinéma avec plusieurs courts-métrages mélangeant l'univers du cinéma à celui du théâtre : Il faut qu'une porte soit ouverte ou fermée (1994), Mécréant (1999) et Première séance (2005).

Dès 1998, il s'aventure à la télévision, participant à des épisodes de Louis la Brocante, d'Avocats & Associés et de L' Ecole du pouvoir. En 2006, il tourne deux fois avec Benoît Jacquot, d'abord dans le téléfilm Gaspard le bandit, et ensuite dans L' Intouchable, où il interprète l'amant d'Isild Le Besco. Le film, Lion d'Or et Prix du jury au festival de Venise 2006, rend son nom plus familier auprès du public, lui permettant d'obtenir ensuite son premier rôle central, dans le deuxième film de Mia Hansen-Løve, Le Père de mes enfants (2009), où il incarne un producteur de cinéma frustré, devant faire face à l'échec de ses productions.

Au Festival de Cannes 2011, son nom est présent dans pas moins de trois films, tous liés au désir et à la perversion sexuelle : L' Apollonide - souvenirs de la maison close de Bertrand Bonello, dans lequel il joue un peintre fasciné par la beauté féminine, My Little Princess d'Eva Ionesco, où il retrouve Isabelle Huppert pour le récit autobiographique d'une photographe érotique, et Polisse, Prix du jury du festival, sur le quotidien de la Brigade de protection des mineurs. En 2011 encore, année qui lui est décidément très favorable, l'acteur est invité par Philippe Ramos à rejoindre Jeanne Captive, une relecture de l'histoire de Jeanne d'Arc, est présent au casting quatre étoiles de la comédie romantique (et chorale) L' Art d'aimer, et campe également un personnage secondaire dans le très remarqué Un Heureux événement.

Après cette année des plus chargées (il est présent dans 6 films !), le comédien débute l'année 2012 en s'affichant à nouveau dans un film évoquant la prostitution, Elles, sous la direction de Malgorzata Szumowska et aux côtés de Juliette Binoche.