Lola Dueñas naît à Madrid, d'un père acteur du petit écran et d'une mère manageuse. Elle fait ses premiers pas en tant que comédienne dans les années 1990 dans des courts métrages et à la télévision espagnole, dans le téléfilm A mi moda (TV) et dans des séries télévisées telles que Periodistas ou, un peu plus tard, Policías où elle tient un rôle récurrent.

On la voit, dans les années 2000, dans ses premiers longs métrages, campant des personnages secondaires dans des genres très variés. En 2002, elle collabore pour la première fois avec Pedro Almodóvar, qui lui propose d'interpréter Matilde, personnage de second plan, dans Parle avec elle. Elle retrouvera Pedro Almodóvar à trois reprises : Volver (2005), film grâce auquel elle remporte un prix d'interprétation féminine collectif au Festival de Cannes avec ses partenaires, Etreintes brisées (2009), puis Les Amants passagers (2013).

En 2004, son rôle dans l'émouvant Mar adentro, d'Alejandro Amenábar, où elle joue avec une grande figure du cinéma espagnol en la personne de Javier Bardem, la révèle à un public plus large et lui vaut un Goya de la Meilleure actrice. On la retrouve ensuite dans Ce que je sais de Lola, A la carte, Angèle et Tony, et parmi les joyeuses bonnes espagnoles des Femmes du 6e étage. Sa prestation dans le drame Yo, También (2009), pour lequel elle reçoit le Goya de la meilleure actrice, est également très remarquée.