Originaire de Kansas City où il naît le 29 novembre 1964 d'un père psychologue et d'une mère responsable de banque, Don Cheadle, dès l'âge de cinq ans, commence à s'intéresser à la scène, à travers la comédie et le jazz. Après une formation musicale et théâtrale pendant ses années de lycée, il s'engouffre dans la seconde voie pour ses études supérieures, en intégrant l'Institute of the Arts de Valencia, en Californie. Il se fait alors connaître comme chanteur, compositeur et saxophoniste dans sa ville natale, et se tourne définitivement vers le cinéma alors même qu'il ne fait pour commencer que des apparitions brèves dans quelques productions de l'époque (Moving violations en 1985). C'est Hamburger Hill en 1987 et Colors l'année suivante, qui le révèlent véritablement.

La télévision fait tout d'abord sa notoriété auprès du grand public. Il participe à plusieurs séries à succès, parfois de manière récurrente, dont Fame, Capitaine Furillo et le Le Prince de Bel-Air, et parallèlement s'adonne au théâtre où il se distingue à la fois comme acteur et comme metteur en scène (Cincinnati Man et The Trip).

En 1995, Cheadle est couronné Meilleur Acteur Secondaire par le "Los Angeles Film Critics Award" pour son rôle dans Le Diable en robe bleue, où il donne la réplique à Denzel Washington. C'est ensuite à Tommy Lee Jones qu'il a affaire, dans Volcano, en 1997. Mais c'est à partir de son incarnation de Sammy Davis Jr. dans le téléfilm The Rat Pack, en 1998, que Don Cheadle commence à enchaîner les seconds rôles vedettes avec constance, dans des succès autant populaires que critiques, qui lui permettent de s'adonner à tous les genres possibles : le monde du porno dans Boogie nights, celui de la politique avec Bulworth, le film familial réflexif avec Family man, le voyage interstellaire dans Mission to Mars, le braquage électronique dans Opération Espadon... Force est de constater que, malgré une récurrence de petits rôles, Don Cheadle parvient à chaque fois à imposer son charisme. Apparaissant indifféremment dans de petits fils indépendants ou de grosses productions, il incarne également un professeur humaniste dans The United States of Leland, l'ami indéfectible de Sean Penn dans le drame The Assassination of Richard Nixon ou le policier de Collision.

Fidèle à Steven Soderbergh, Don Cheadle interprète sous sa direction un malfrat boxeur (Hors d'atteinte), un flic tenace (Traffic) ainsi qu'un braqueur cool dans Ocean's eleven (2002) et sa suite Ocean's 12 (2004). Il rejoint un autre casting prestigieux, dans Coup d'éclat avec Pierce Brosnan et Salma Hayek. L'année 2005 marque un tournant décisif dans sa carrière, puisque pour la première fois, il tient le premier rôle d'un grand film, Hotel Rwanda, qui lui vaut plusieurs prix et nominations. Fort de ce succès, il passe à la réalisation avec un projet ambitieux : l'adaptation d'un roman d'Elmore Leonard, Tishomingo blues, où il se met en scène aux côtés de Matthew McConaughey. On le retrouve une nouvelle fois dans le rôle de Basher dans Ocean's 13, toujours réalisé par Soderbergh.

En février 2009, on peut le voir à l'affiche de deux films très différents : dans un premier temps, il reprend sa double casquette de producteur/acteur avec Trahison, le premier film réalisé par Jeffrey Nachmanoff, dans lequel il interprète un ancien officier des opérations spéciales US Samir Horn soupçonné de trahison envers son pays. Et dans un second temps, il se tourne vers un rôle beaucoup plus léger dans la comédie pour jeunes ados Palace pour chiens. Il est aussi à l'affiche du film d'Antoine Fuqua, L' Elite de Brooklyn, présenté au Festival de Venise, dans lequel il partage la vedette avec Richard Gere, Wesley Snipes et Ethan Hawke. En 2010, il reprend le rôle laissé vacant par Terrence Howard dans la suite des aventures du super-héros interprété par Robert Downey Jr., Iron Man 2.