Après des études d'anglais et d'histoire, Catherine Keener déménage à New York et trouve un emploi d'assistante d'un agent de casting. Ce dernier la pousse alors à devenir actrice. Ses débuts de carrière se révèlent assez difficiles. Elle n'obtient d'abord que de toutes petites apparitions comme dans A propos d'hier soir (1986) d'Edward Zwick ou Dans la peau d'une blonde (1991) de Blake Edwards. Elle arrive à décrocher un petit rôle dans Thelma et Louise de Ridley Scott, mais ses scènes sont coupées au montage. De même, elle n'est pas non plus créditée pour sa courte apparition dans Les Veuves joyeuses.

Sa carrière prend un nouveau tournant quand elle fait la connaissance de Tom DiCillo. Les quatre films qu'elle tourne avec le cinéaste indépendant new-yorkais, Johnny Suede (1991), Ça tourne a Manhattan (1995), Box of moonlight (1996) et Une vraie blonde (1997), commencent à la révéler. Ainsi, Nicole Holofcener lui offre un des deux rôles principaux de Walking and Talking (1996) aux côtés d'Anne Heche. Cinq ans plus tard, la réalisatrice fait à nouveau appel à elle pour les besoins de Lovely & amazing. Parallèlement à ces films indépendants, Catherine Keener tient quelques rôles secondaires dans ses premières grosses productions hollywoodiennes, Hors d'atteinte et 8mm huit millimètres.

En 1999, le succès inattendu de Dans la peau de John Malkovich de Spike Jonze la lance définitivement, et la comédienne obtient sa première nomination à l'Oscar de la Meilleure actrice dans un second rôle. Elle côtoie ensuite plusieurs très grandes stars, comme Robin Williams et Edward Norton dans Crève, Smoochy, crève ! (2002), Julia Roberts dans Full frontal (2002) et Al Pacino dans Simone, une star est... créée.

Catherine Keener devient vite une actrice incontournable respectée par les jeunes réalisateurs hollywoodiens. Ainsi, elle saisit la chance de jouer aux côtés de Daniel Day-Lewis, rarissime à l'écran, dans The Ballad of Jack and Rose (2005), réalisé par la femme de l'acteur irlandais, Rebecca Miller. Elle tourne aussi sous la direction de réalisateurs expérimentés, comme Sydney Pollack qui l'engage pour L'Interprète, film très attendu en 2005. Très sollicitée cette année là, la comédienne rejoint Philip Seymour Hoffman qui interprète Truman Capote, dans le film éponyme, qui lui vaut une nouvelle nomination aux prix de l'Académie américaine.

Fidèle des productions indépendantes et très appréciée de ses anciens collaborateurs, elle est invitée encore une fois par Nicole Holofcener à jouer dans Friends With Money (2006) et La Beauté du geste (2010), tandis que Charlie Kaufman (scénariste de Dans la peau de John Malkovich) fait appel à ses services pour son premier film en tant que réalisateur, Synecdoche, New York (2008), et que Spike Jonze la sollicite à nouveau pour Max et les maximonstres (2009). Quant à Sean Penn, il la choisit pour incarner un second rôle dans son aventure biographique Into the Wild (2007).

En 2010, après une rare apparition dans une grosse production hollywoodienne, Percy Jackson le voleur de foudre, dans lequel elle joue la mère de l'adolescent aux pouvoirs magiques, l'actrice priorise toujours les projets dramatiques à petit budget, comme Cyrus, où elle donne la réplique à trois autres comédiens habitués des films indépendants (John C. Reilly, Marisa Tomei, Jonah Hill), et Trust, une histoire centrée sur le thème de la pédophilie, constituant également la deuxième incursion de l'acteur David Schwimmer dans la mise en scène pour grand écran.